摘要 实时荧光定量pcr技术是在普通pcr定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量pcr技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。
关键词 荧光定量pcr技术;原理;主要类型;定量方法;优化
abstract real-time fluorescent quantitative pcr is a new kind of nucleic acid quantitative technique,which develops in the pcr qualitative technique base. it has been widely used in different research fields. in the paper,the experiment principles,the main types and quantitative methods of this technology were described. the control of experimental conditions,affecting factors and optimization of experimental results were discussed.
key words real-time fluorescent quantitative pcr;principle;main types;quantitative method;optimizing
实时荧光定量pcr技术于1996年由美国applied biosystems公司推出,该技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在
现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。
1 荧光定量pcr技术的原理
荧光定量pcr技术是在pcr反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规pcr无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量pcr技术是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个pcr循环反应,定量pcr仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,pcr产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量pcr 反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(cycle threshold,ct)。ct值是pcr扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,ct值取决于阈值。经数学证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与ct值存在线性关系。起始拷贝数越多,ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。
2 荧光定量pcr技术的主要类型
荧光定量pcr所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以sybr greenⅰ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括taqman、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。
2.1 sybr greenⅰ
sybr greenⅰ是一种能够与双链dna小沟结合的染料。在游离状态下,sybr greenⅰ发出微弱的荧光,但是一旦与双链dna结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链dna量成正比,可以根据荧光信号检测出pcr体系中的双链dna的数量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。sybr greenⅰ的缺点在于它能够和所有的双链dna相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化pcr的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。
2.2 taqman探针
taqman探针技术是有美国perkin elmer(pe)公司研制的一种实时pcr定量技术,在pcr扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在pcr扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,taq dna聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和pcr 产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量[8]。taqman探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高[9]。
2.3 分子信标
分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶dna序列互补,为15~35 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶dna无序列同源性,约8 bp。在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高[10]。
3 荧光定量pcr技术的定量方法
实时荧光定量pcr技术是dna定量技术的一次飞跃。运用该技术,可以对dna、rna样品进行定量和定性分析。定量方法包括绝对定量和相对定量。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的2个样本中的基因表达水平进行比较。
3.1 标准曲线法的绝对定量法
用一系列已知浓度的标准品,作为模板进行pcr反应,以标准品浓度的对数值为横坐标,以测得的ct值为纵坐标,绘制标准曲线,在相同条件下检测未知样品的ct值,从而根据标准曲线计算出未知样品的浓度(拷贝数)。制作1个好的标准曲线对定量结果至关重要,在制作标准曲线时,应至少选择5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围,最好与目的基因有较高的同源性;绝对定量标准品通常可以是纯化的质粒dsdna,体外转录的rna,或者是体外合成的ssdna、标准品的量可根据260 nm的吸光度值并用dna或rna的分子量转换成其拷贝数来确定。
3.2 双标准曲线法的相对定量法
在某些不需要对基因进行绝对定量、只需要确定基因相对表达差异的情况下,如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了,用相对定量的方法就可以得到结果。双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,并用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线,处理与未处理样品同时扩增目的基因和管家基因,获得ct值,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。定量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对所用的标准品不需要知道绝对拷贝数,只要知道其相对稀释度即可。通常选用的管家基因有gapdh、β-actin、β2-微球蛋白和rrna。此方法在扩增效率较低、目标基因与管家基因扩增效率有差异时适用,且需要很精确的结果计算。
3.3 比较ct法的相对定量法
如果反应条件控制较好,扩增效率较高,目的基因和管家基因的扩增效率基本一致,这时就不需要作标准曲线,而是通过与管家基因ct值之间的相差来计算目的基因的表达差异。比较ct法运用了数学公式来计算相对量,前提是假设每个循环增加1倍的产物量,根据数学推导得出:
目的基因的量=2-δδc t
在该公式中,δδct=(ct目的基因-ct管家基因)实验组-(ct目的基因-ct管家基因)对照组。因此,2-δδc t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线[11]。
4 荧光定量pcr技术实验条件的优化
定量pcr技术已经在生物学研究中得到了广泛的应用,技术也日臻完善,并且敏感度极高,特异性强;正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,必须根据不同的反应类型优化实验条件,如特异性探针及引物的设计、选择合适的mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等,规范操作步骤,并仔细配制pcr反应体系。
4.1 引物及探针
一是设计要求。引物设计是实时定量pcr中最重要的一步,扩增片段长度根据技术的不同有所区别:sybr greeni技术要求扩增片段不大于500 bp,taq man探针技术要求扩增片段长度在50~150 bp。引物序列选取应在基因的保守区段并具有特异性,长度一般为18~24 bp,避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,引物自身不能形成环状发卡结构,熔解温度tm值在55~65 ℃,gc含量在40%～60%,上、下游引物之间的tm值相差不要超过4 ℃。在taqman探针的设计上要求绝对保守,长度为30~45 bp,tm值在68~70 ℃,探针的5’端不能为g和避免多个碱基同时出现,探针应尽可能靠近上游引物。二是浓度。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性,引物浓度太低会致使反应不完全,引物浓度太高会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0.1~0.6 μmol/l,探针的浓度在0.05~0.30 μmol/l,可以在这个基础上再进一步优化,以达到引物探针整体的最佳浓度。三是稳定性。一般从生物技术公司定制引物是以干粉形式运输的,使用时最好用te溶液溶解,使其最终浓度为100 μmol/l,-20 ℃保存。纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以长达1年以上。由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2 μmol/l(10×),作为工作浓度分装多支,避光保存。四是退火温度。退火温度一般设定比引物的tm值低5℃。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度一般为55~70 ℃。
4.2 模板质量与浓度
模板的质量会影响pcr扩增的效率。模板应在-20 ℃保存,避免反复冻融。用te溶液溶解和稀释模板,这能大大延长保质期。模板浓度应根据ct值选择,使ct值位于15～30个循环比较合适,若ct值大于30,则应提高的模板浓度;如果小于15,则应降低的模板浓度。
4.3 镁离子浓度
mg2+是影响taq酶活性的关键因素。mg2+的浓度过高,会增加非特异性扩增,降低忠实性;mg2+的浓度过低影响taq酶发挥最佳活性。一般来说,对以dna或cdna为模板的pcr反应,应选择2~5 mmol/l浓度的mg2+。
4.4 循环数
一般的实时定量pcr反应只需25～30个循环便可获得满意的结果,但是对于那些极微量的待测样本而言,适当增加循环数可以提高反应的检出底限,建议循环数为40个,但是并非循环数增加的越多,其敏感性就会越高。实际上,当循环数增加到某一值时,敏感性便不再升高。
4.5 重复实验和阴性、阳性对照
定量实验,误差是不可避免的,设立重复实验,对数据进行统计处理,可以将误差降低到最小,因此定量实验的每个样本至少要重复3次以上。为了增加pcr扩增反应的可信度,在扩增的同时,需进行阴性、阳性对照反应。阴性反应中不加模板dna,而以水或缓冲液代替,用于检验是否存在pcr污染。阳性对照则用于检验pcr试剂和实验操作上可能出现的问题。相对来说,仪器、pcr 试剂、sybr greenⅰ染料是很稳定的,而操作和模板是薄弱环节,模板的加入量一定要准确,为确保实验数据的有效性,每个样品至少平行做3次重复。使用微量移液器时,如果不仔细,就会产生较大的用量误差甚至错误。在实验过程中应当避免室温下混合各种试剂,应在冰上进行,避免所配体系产生气泡,并且在一经混合后立即开始进行扩增。
5 结语
通过设计针对目的基因的特异性引物和探针,并优化反应体系和控制反应条件,可以成功地建立快速、灵敏、特异的荧光定量pcr检测方法,实现大样本同时检测,节省大量的时间和反应成本。随着基因科学技术的发展,荧光定量pcr技术将会深入和拓展,在现代农业中得到更广泛的应用。
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