濒危高原植物羌活化学成分与生态因子的相关性

　　我国气候生境的多样性,形成了特有的中药材多道地、多产地现象1。道地药材的生长要求特定的生长温度、湿度、降水等自然生态环境条件。研究适宜道地药材生长的生态环境是中药资源可持续发展的重要命题0。中药资源生态学是中药资源与生态学相结合的一门新兴学科H,中药材品质与生态因子相关性研究是其重要组成部分?。课题组前期研究表明，相对湿度和年降水量是影响黄花蒿中青蒿素积累的主导因子S。温度在人参中的皂苷类成分的积累中起着决定性作用63。Jmg&]等认为土壤类型是影响枸杞多酣类含量的主要因素。ShutingYang等68发现玄参中玄参苷的积累与温度呈正相关性。

　　羌活为大宗药材品种。具有解表散寒、胜湿止痛的作用，为中、藏、羌医药体系中的常用药材,主要化学成分是羌活醇和异欧前胡素011。四川、青海、甘肃为羌活三大主产区M。羌活主要分布于高原寒冷阴湿地带，生长周期长M,加之市场需求增长,野生资源已面临严重危机M。《中国珍惜濒危保护植物名录》已将羌活列为二级保护物种,并载入《中国物种红色名录》M。目前对羌活的研究集中在真伪鉴别及质量评价方面,对羌活产地的生态因子与其化学成分的关联尚无报道。本研究对四川、青海、甘肃羌活主产地羌活的羌活醇和异欧前胡素进行含量测定,应用中国气象科学数据共享服务平台（http：//)获得了不同产地的生态因子值,应用偏最小二乘回归分析（PLS)、冗余分析（RDA)及主成分分析（PCA)方法探讨了羌活活性成分与产地及气候因子的关联性,研究结果为濒危物种羌活保护与利用、可持续发展及引种栽培提供参考。

　　1材料、仪器与试剂1.1材料

　　栽培羌活、宽叶羌活两年生药材于2010年10月下旬采收自四川、甘肃、青海等省,栽培羌活54个样品，宽叶羌活11个样品共计65个样本（图1)。将药材粉碎,过3号筛,经HPLC测定其含量。原植物由中国医学科学院药用植物研究所黄林芳副教授鉴定为羌活（m)和宽叶羌活（etii)。

　　1.2仪器与试剂1.2.1仪器

　　Waters1525HPLC系统（Milford,MA,USA),WatersAF型在线脱气机，Waters1525HPLC型二元泵，Waters717型自动进样器,恒温柱箱以及Breeze色谱工作站。

　　1.2.2试剂

　　甲醇、乙腈（Fisher,色谱纯）、磷酸（Sigma,色谱纯）、其余试剂为分析纯。

　　2方法

　　2.1羌活化学成分含量测定2.1.1对照品

　　异欧前胡素（批号：110827)购自中国药品生物制品检定所，羌活醇（批号:0773-9607)购自上海同田生物,纯度经高效液相色谱分析大于98%。

　　2.1.2对照品溶液制备

　　分别精密称取2mg羌活醇和异欧前胡素分别溶于甲醇中，振摇使混合均匀，配制成混合对照品储备液。4°C冰箱储存备用。

　　2.1.3供试品溶液的制备

　　分别取约2.0g羌活、宽叶羌活样品，精密称定,加入25mL甲醇至具塞锥形瓶中，称重。超声30min处理后补足差重。过滤,进样前经0.22^m滤膜过滤,取续滤液,准备进样。

　　2.1.4色谱条件

　　XBridgeC^色谱柱(250mmX4.6mmX5(xmi.d.,Waters,USA),柱温35C,流速1.0mL/min,样品进样体积10xL。流动相组成乙腈（A)和0.01%磷酸水（B)。检测波长310nm。色谱条件如下&1'15]：0-13min,13%-17%A；13-20min,17%A；20-22min,17%-44%A；22-31min,44%-57%A；31-38min,57%A;38-45min,57%-100%A;45-50min,100%A。

　　2.1.5线性关系考察

　　分别精密吸取混合对照品储备液2、10、40、100、200、400、600xL至1mL量瓶中，加甲醇至刻度，按上述色谱条件进行HPLC分析，以各标准品的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标（Y)进行线性回归,得到各线性回归的方程。最小检测限（LOD)和最小定量限（LOQ)定义为信噪比分别等于3(S/N=3)和10(S/N=10)时对应的含量（表1)。

　　2.1.6精密度试验

　　分别在1d和连续3d内吸取上述混合标准储备液400xL,稀释至1mL,进样体积10xL,在所确定的HPLC条件下重复进样6次测定,记录各成分色谱峰面积,计算其质量分数。结果羌活醇、异欧前胡素在72h内的RSD为2.26%,1.71%。

　　2.1.7稳定性试验

　　取上述对照品溶液,分别在0、、4、8、12、24、36h,按上述测定方法进行测定,记录峰面积,各对照品色谱峰的峰面积对应的浓度的RSD值在1.06%和1.02%范围内，表明样品至少在36h内稳定。

　　2.1.8重现性试验

　　取同一批次的样品各6份,按供试品溶液制备方法制备,按照上述色谱条件测定,各对照色谱峰的峰面积在0.14%-0.55%范围内，表明此方法的重现性良好。

　　2.1.9加样回收率

　　取已知含量的同一批次的样品6份,每份约2.0g,精密称定,分别精密加入一定量（相当于样品中的量）各对照品,按供试品溶液的制备方法操作,按上述色谱条件测定,各对照品的回收率在95.57%-99.23%范围内。

　　2.2生态因子与化学成分分析（PLS)

　　2.2.1生态因子获取

　　登录中国气象科学数据共享服务网数据查询系统，中国地面国际交换站累年年值数据集。包括9个因素：年降水量，年平均温度,年平均最低温度,年平均最高温度,年相对湿度，日照时数,海拔,年平均风速，年平均气压(表2,表3)

　　2.2.2生态因子与化学成分PLS分析及产地主成分分析（PCA)

　　应用simca^p软件对生态因子和含量数据库进行建模,考虑p个因变量y1,2,-,yp,m个自变量x1,2,…,xm,首先在自变量中提取第一主成分t1,因变量中提取第一主成分u1,使t1和u1的相关程度达到最大，然后建立因变量y1,2,???,,于t1的回归。如果方程已达到满意的精度,则算法终止。选择信息提取和解释能力较强的主成分作为典型成分。用Canoco软件对化学成分数据先进行去趋势对应分析（DCA),观察模型的整体情况,然后将环境因子数据加到排序图上，进行冗余分析（RDA)。解读排序图，两个箭头之间的夹角的余弦值代表了之间的相关性。余弦值的大小代表了两者之间关系的强弱。用Unscrambler结合气象数据与化学数据进行主成分分析,找出具有代表性的因子，区划最优产地。

　　3结果

　　3.1羌活与宽叶羌活化学成分含量分析

　　图2、图3可见,羌活中羌活醇含量较高，异欧前胡素含量较低,而在宽叶羌活中羌活醇的相对含量较低，异欧前胡素的含量较高。由图3可知，羌活与宽叶羌活在不同产地中化学含量存在明显差异，四川产羌活化学含量较青海高。宽叶羌活中不同产地化学含量比较,异欧前胡素含量显著高于羌活醇,尤其在甘肃产宽叶羌活中。

　　3.2羌活及宽叶羌活化学成分与生态因子PLS分析

　　采用偏最小二乘模型回归系数的迭代计算与辅助分析技术,通过变量投影重要性指标（VIP)来评估羌活化学成分与生态因子关联性,值越大说明解释变量的重要程度越大。在羌活中羌活醇和异欧前胡素的回归系

　　数见图4(A、C),变量投影重要性指标VIP见图4(B、D)。

　　由图4(A)可知，羌活中日照时数与羌活醇含量的正回归系数绝对值最大，其次是年降水量，相关度的排序为日照时数>降水量>年最高温度>海拔>年均温度>年最低温度。风速与羌活醇的负回归系数绝对值最大,其次是气压和湿度。图4(B)的VIP直方图，曰照时数和年降水量的权重系数与其它变量相比影响最大，其后依次是海拔>年最高温>风速>气压>年均温>年最低温>湿度。综合图4(A)和（B)可知，日照时数和年降水量是影响羌活中羌活醇含量的最主要因素，且为正相关。海拔与年最高温度也与羌活醇呈正相关。羌活中另一个主要化学成分异欧前胡素的生态因子系数回归图如图4(C)所示，日照时数与异欧前胡素的含量回归系数为正值,其余生态因子都为负值。其中年降水量的负回归系数绝对值最大。年均温、年最高温、年最低温与异欧前胡素的负回归系数排在第二,湿度和气压的负回归系数排在第三。图4(D)的异欧前胡素VIP生态因子直方图中，年降水量的权重系数最大排在第其次为年最高温《年均温《年最低温排>气压《风速《海拔《湿度>曰照时数。年降水量和温度因素是影响异欧前胡素含量的主要因素，皆为负相关。通过4个图比较,发现在羌活中影响羌活醇和异欧前胡素含量的生态因子呈相反的趋势，如日照和年降水量、海拔、温度与羌活醇都为正相关,而与异欧前胡素呈负相关。

　　宽叶羌活中羌活醇和异欧前胡素的生态因子回归系数见图5(A,C)和变量投影最要性指标VIP见图5(B,D).从图5(A)中可看出，在宽叶羌活中海拔与羌活醇含量呈正相关，且回归系数最大，其后依次是年降水量>风速>湿度>日照。气压与羌活醇的负回归系数绝对值最大，呈强负相关关系，其次是年均温>年最高温>年最低温。图5(B)的VIP直方图可见,海拔、风速和年降水量分别排在前3位,是影响宽叶羌活中羌活醇的主要因素，其次为气压>年均温>年最低温>年最高温>曰照>湿度,宽叶羌活中高海拔,和高风速,高降水有利于羌活醇的积累。结果同影响羌活中羌活醇的生态因子相一致。图5(C)宽叶羌活异欧前胡素的系数回归图中，海拔的负回归系数绝对值最大。年降水量,风速和湿度排在其次。年最高温,年最低温,年均温负回归系数最小。日照时数和气压与其呈正相关。图5(D)中，海拔、年降水量和风速对异欧前胡素含量的影响最大。年最高温、年均温、年最低温、湿度、气压、日照对异欧前胡素的影响排在其次。

　　2.3不同产地羌活和宽叶羌活含量与生态因子的RDA双向排序图

　　如图6(A)所示，图中的蓝色箭头代表羌活的化学含量，红色箭头代表生态因子。以羌活中的羌活醇为例,其与日照时长,和平均风速的夹角分别为a,(5,前者是个锐角，后者是个钝角，相应的余弦值代表了之间的相关性,羌活醇与日照时长呈现了较好的正相关，与平均风速呈现了较好的负相关。年降水量、年平均温度、年最高温度、年最低温度、海拔都与羌活醇呈较好的正相关。气压、相对湿度与羌活醇呈较好的负相关，与3.1的研究结果相符合。异欧前胡素与相对湿度,平均风速,气压呈现较好的正相关，与日照时数呈现微弱的正相关，与海拔、年最高温度、年最低温度、年均温度、年降水量呈现较好的负相关，与上述结果有细微的差别，可能是不同分析方法所致,Canoco先对模型进行去趋势对应分析（DCA),选中合适的模型,然后采用冗余分析(RDA)进行排序，主要采用排列方法学的生态模型。如图6(B)所示宽叶羌活中的羌活醇与年降水量、海拔、风速、日照时数的夹角为锐角，呈现出良好的正相关，与相对湿度呈微弱的正相关。并且与年平均温，年最高温,年最低温,气压的夹角是钝角，呈现出负相关。异欧前胡素与气压，年最高温,年最低温,年均温夹角为锐角，呈正相关。与相对湿度，日照时数,年降水量，海拔的夹角为钝角，呈负相关。与上述PLS结果有些差别，虽然温度因子在两种计算方法中出现了相反的趋势,不过由于温度因子的解释变量的重要性小于海拔和年降水量,对分析结果影响不大，主导的生态因子通过两种软件的分析结果的相同的。

　　3.4基于羌活化学成分的PCA分析

　　利用simca^p软件包对不同产地羌活中羌活醇和异欧前胡素进行主成分（PCA)分析（图7A),发现四川的样品主要集中在PCA三维图的左下半部分,青海的样品主要集中在左上半部分,并且比四川的样品更为密集。这与采样点的分布极为相似,根据不同产地之间成分的差异能很好的区分开来。四川产地的样本主要集中在PC1的一侧,说明其贡献率在第一主成分比例很高，四川产羌活的羌活醇和异欧前胡素要高于青海省,验证了其道地产区的特点。宽叶羌活化学成分含量PCA分析发现，四川的产地亦主要集中在PCA三维图的左下半部分（图7B)。甘肃的产地主要集中在左上半部分，与羌活产地的分布相类似，四川产地集中在第一主成分的一侧,表明其含量要高于甘肃产地。

　　4讨论

　　生态环境对中药材的品质有一定影响M。根据产地羌活可分为川羌和西羌,川羌主产于四川省阿坝藏族自治州小金、松潘、甘孜藏族自治州。西羌主产于青海,甘肃等。化学成分含量测定结果表明羌活中羌活醇含量高于异欧前胡素,而宽叶羌活相反。两种羌活的化学成分含量都以川羌最高。羌活化学成分与生态环境、地理分布密切相关,羌活药材品质是基于特有生态条件与栽培技术的综合体现。诸如日照时数、年降水量、海拔有利于羌活中羌活醇含量的积累,而年降水量与海拔则不利于异欧前胡素含量的积累,从而影响药材品质。

　　4.1活性成分与日照时数生态因子的关系

　　活性成分与日照时数均呈正相关关系。通过对图4(A,C)比较发现，日照时数与羌活中羌活醇的正回归系数大于异欧前胡素，而在图5(A,C)宽叶羌活中，日照时数与羌活中羌活醇的正回归系数小于异欧前胡素。羌活为短日照植物,怕强光,羌活与宽叶羌活对光照的适应能力均较强，同一海拔地区的自然光强平均值介于21000-28000lx,羌活植株在该地区上方的光强平均介于1080-1320lxa7],这与其在弱光的生长条件下相吻合。研究表明&8,羌活的表观量子率显著高于宽叶羌活，说明羌活对弱光的利用能力强于宽叶羌活。羌活较宽叶羌活多生长在较高的海拔,其多分布在较为隐蔽和冰冷的生境中，而宽叶羌活生长在相对较为开阔、光照较好的灌丛或者针阔混交林一带，即隐蔽的生境下弱光更弱，曝露的生境中强光更强。高海拔时羌活接受弱光曰照时数长,羌活醇的积累高于异欧前胡素。而在相对海拔较低时,宽叶羌活接受强光日照时数长,异欧前胡素的富集高于羌活醇。羌活醇与异欧前胡素累积与光照强弱的相关性,有待进一步研究。

　　2.2活性成分与年降水量、海拔生态因子的关系

　　通过图5(A,C)比较发现,年降水量及海拔均能促进羌活及宽叶羌活中羌活醇含量积累，不利于异欧前胡素积累。羌活主要分布在高海拔地区（3700m以上）,降水多，有利于羌活醇含量积累。宽叶羌活则主要分布在1600m中海拔区，海拔、年降水量相对较低，有利于异欧前胡素的富集。四川为羌活道地产区，尤以小金、理县、黑水、道孚、炉霍等县较多,该地区属亚热带气候,高原地形，降水量大，空气湿润，季节变化及昼夜温差大。适宜种植羌活。在川西高原川藏交界的一些河谷、甘南和青海等省的部分耕地充足，光热条件优越的低海拔地区适宜种植宽叶羌活。

　　综上所述,本文首次应用PLS,RDA双序排序等方法分析了生态因子对含量的影响以及相关性。揭示了曰照时数、年降水量及海拔对羌活、宽叶羌活中活性成分累积起重要作用。探讨了弱光更利于羌活醇含量积累,强光适于异欧前胡素累积。在一定范围内，海拔越高，年降水量越大,越能促进羌活醇的积累,而不利于异欧前胡素含量富集。研究结果对保护濒危高原药用植物羌活、加强引种栽培及其资源可持续发展提供科学依据。