教学用模拟患者血清标本的制备与评价

　　[中图分类号] R446.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0025-04

　　Preparation and evaluation of patient serum analogue for experimental teaching

　　GAO Huacong1 WANG Xiaoming2 ZHANG Lili2 WU Dachang1 SHA Shanshan1

　　1.College of Basic Medical Sciences， Dalian Medical University， Liaoning Province， Dalian 116044， China； 2.Medical College， Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116622， China

　　[Abstract] Objective To obtain patient serum analogues with classic biochemistry properties and can be used for experimental teaching， acquire their optimum storage temperature and quality guarantee period. Methods The 1% yeast extract solution was firstly prepared as basal solution. To prepare patient serum analogue of diabetes， hypertriglyceridemia， nephrotic syndrome and cirrhosis， amount of 14.0 mmol/L glucose and 10.0 mmol/L tiacylg lycerol， 10.0 mmol/L tiacylg lycerol， 28 g/L albumin and 10.0 mmol/L tiacylg lycerol， and 28 g/L albumin and 60 U/L aspartate aminotransferase were added to basal solution， respectively. The changes of these additives were detected after storage at room temperature， -4℃ and -20℃ for 1， 7 and 30 days， respectively. Results The prepared patient serum analogues showed a similar appearance with the clinic serum. The patient serum analogue of diabetes， hypertriglyceridemia， nephrotic syndrome and cirrhosis showed its corresponding character of raised glucose and tiacylg lycerol， raised tiacylg lycerol， raised tiacylg lycerol and reduced albumin， and raised aspartate aminotransferase and reduced albumin， respectively. Except for albumin in nephritic syndrome， all additives had no changes within 30 days when storage at -20℃ （P > 0.05）. Conclusion This article obtains four kinds of patient serum analogues which can be used for experiment teaching， and their optimum storage temperature and quality guarantee period are confirmed.

　　[Key words] Biochemistry； Experiment teaching； Serum sample； Storage temperature； Quality guarantee period 　　血清是医学院校生物化学和临床生物化学检验课程实验教学中应用最多的标本。学生通过检测血清中蛋白质、脂类、糖、酶等物质的含量，学习相关的技术方法，并理解疾病发生时血清中各物质含量的变化。目前，血清标本主要来源于医院检验科和血库，且多为正常人血清标本。而教学效果更加良好的患者血清标本，常因医院检验科需要重复检测或生物安全问题而难以获得[1-3]。即使获得了少量的患者血清，有时也会因为其成份复杂、稳定性差等原因，无法在运送或存放一定时间后获得稳定的阳性检测结果[4-6]。如能人工制备某些疾病的模拟血清，将很好地解决上述问题。目前，关于单一成分血清标本（如高血糖血清标本）已有制备方法[7-10]，但对于多组分血清标本的配制尚无报道。本研究利用1%的酵母粉溶液中添加化合物或酶液的方法，人工制备4种具有典型生化特征、可用于生物化学实验教学的模拟患者血清标本，并确定它们的最适贮存温度和时间，现报道如下：

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　葡萄糖（Glu）、白蛋白（Alb）、三酰甘油（TG）购自国药集团化学试剂有限公司。酵母提取物购自Oxoid。Glu、TG、Alb和谷草转氨酶（AST）的检测试剂盒购自南京建成科技有限公司。SPF级、体重（20±2）g雌性BALB/c小鼠购自大连医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（辽）2008-0002。

　　1.2 基底液和各添加物标准液的配制

　　基底液的配制：称取酵母提取物，配制成1%（W/V）酵母粉水溶液，高压灭菌。鼠肝匀浆液（约含300 U/L AST）的制备：小鼠脱颈椎处死，立即剖腹取出肝脏，称取0.7 g鼠肝，加入5 mL PBS，冰上匀浆，4000 r/min离心5 min，取上清液-20°C保存。另外，按常规方法配制1.0 mol/L Glu标准液和400 g/L Alb标准液。

　　1.3 模拟患者血清标本的配制和生化指标检测

　　模拟糖尿病患者血清的配制：在基底液中加入1.0 mol/L Glu标准液和1.035 mol/L TG，使其理论上终浓度分别达到14.0 mmol/L和10.0 mmol/L。模拟高甘油三酯血症患者血清的配制：在基底液中加入1.035 mol/L TG，使其理论上终浓度达到10.0 mmol/L。模拟肾病综合征患者血清的配制：在基底液中加入1.035 mol/L TG和400 g/L Alb标准液，使其理论上终浓度分别达到10.0 mmol/L和28 g/L。模拟肝硬化患者血清的配制：在基底液中加入鼠肝匀浆液和400 g/L Alb标准液，使其理论上终浓度分别达到60.0 U/L和28 g/L。根据检测试剂盒的操作说明，检测模拟患者血清标本中各添加物实际可检测到的含量。

　　1.4 模拟患者血清标本保存条件的确定

　　将各模拟血清标本分别置于室温、4℃、-20℃条件下保存，分别于第1、7、30天，根据试剂盒的操作说明检测模拟血清标本中各添加物的含量。

　　1.5 统计学方法

　　所有测定设立3个实验重复，采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，并利用随机区组单因素方差分析，将模拟血清标本保存后的各指标含量与配制当天相比较，从而确定模拟血清的最适存贮温度和保质时间。以P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 模拟患者血清标本外观及各指标含量

　　配制的4种模拟患者血清目测均为澄清、淡黄色、具有一定黏度的溶液，与临床血清外观极为相似。配制当天4种标本中各生化指标均偏离正常值范围，体现相应疾病发生时的变化特征（表1）。其中，糖尿病患者临床常表现为尿糖、高血糖、高血糖化血红蛋白，多数患者还出现TG和/或胆固醇升高[11-13]；制备的模拟血清体现了Glu和TG升高两个显著特征。高甘油三酯血症患者临床表现为胆固醇和/或TG含量升高[13-15]；制备的模拟血清具有TG升高的特点。肾病综合征患者临床常表现为多尿、水肿、低白蛋白血症，很多患者会合并高脂血症[13，16]；制备的模拟血清具有Alb降低、TG升高两个显著特征。肝硬化患者临床常表现为水肿、胸腹腔积液、血液中转氨酶活性和胆红素升高、Alb含量降低[13，17-18]；制备的模拟血清具有谷草转氨酶活性升高、Alb含量降低两个显著特征。

　　表1 模拟患者血清标本的各指标含量（x±s）

　　注：Glu：葡萄糖；TG：三酰甘油；Alb：白蛋白；AST：谷草转氨酶；“-”表示未检测

　　2.2 模拟患者血清标本贮存温度和时间的确定

　　2.2.1 模拟糖尿病患者血清 制备的模拟糖尿病患者血清在室温保存1 d后Glu和TG含量较血清配制当天[Glu：（14.99±0.31）mmol/L，TG：（2.93±0.08） mmol/L]即开始下降（P < 0.05）；4℃保存7 d尚可，但保存30 d后Glu降至正常值范围；-20℃保存30 d后，Glu和TG值与血清配制当天差异无统计学意义（P > 0.05）。因此，此标本不可在室温保存，可在4℃短期保存，-20℃可保存至少30 d。见表2。

　　表2 模拟糖尿病患者血清保存后各指标的变化（x±s）

　　注：Glu：葡萄糖；TG：三酰甘油

　　2.2.2 模拟高甘油三酯血症患者血清 制备的模拟高脂血症患者血清在室温保存30 d后，TG含量下降至正常值范围；在4℃和-20℃保存30 d后，TG含量虽然有所波动，但与血清配制当天[（3.03±0.32）mmol/L]比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。这表明，此标本在室温只可保存7 d，但在4℃或-20℃至少可以保存30 d。见表3。

　　表3 模拟高甘油三酯血症患者血清保存后三酰甘油浓度的变化（mmol/L，x±s） 　　2.2.3 模拟肾病综合征患者血清 模拟肾病综合征患者血清TG和Alb含量分别在室温保存30 d和-20℃冻融后与血清配制当天[TG：（2.08±0.37）mmol/L，Alb：（25.85±0.97）g/L]比较有所下降（P < 0.05）。除此之外，模拟标本在各种条件下保存30 d后TG和Alb含量均无显著性变化（P > 0.05）。是此标本在4℃和-20℃可保存至少30 d，但尽量避免反复冻融。见表4。

　　表4 模拟肾病综合征患者血清保存后各指标的变化（x±s）

　　注：TG：三酰甘油；Alb：白蛋白

　　2.2.4 模拟肝硬化患者血清 模拟肝硬化患者血清在室温保存时Alb与血清配制当天[（27.66±0.86）g/L]比较，基本无变化（P > 0.05），但7 d后AST活性较血清配制当天[（82.67±0.02）U/L]开始下降并接近正常值范围。4℃保存血清时Alb相对稳定，AST有所下降。-20℃保存时，Alb和AST活性一直偏离正常范围值。因此，此标本不能在室温保存，在4℃可短期保存，在-20℃可保存至少30 d。见表5。

　　3 讨论

　　物质代谢及其规律是生物化学课程的授课重点，掌握疾病相关的血液生化特征是医学生生物化学和临床生物化学实验教学的主要目的之一。近年，各医学高等院校广泛开展了以临床案例为导向的生物化学CBL教学，并取得了良好教学效果[19-20]。也有少数院校将CBL教学方式引入至生物化学的实验教学中，来提高学生对实验课的兴趣，并培养学生综合分析问题的能力[21-23]。具有明显疾病特征、检测结果稳定、使用安全的患者血清标本是生物化学CBL实验教学不可缺少的组成部分。为此，本研究根据糖尿病、高甘油三酯血症、肾病综合征和肝硬化的基本生化特征，利用基底液中添加标准液的方法，建立了模拟患者血清标本的快速简便制备方法。结果表明，配制的模拟血清各指标均达到了预期的“升高”或“降低”的模拟目的。各模拟血清在-20℃均可保存至少30 d，但在4℃和室温时情况各不相同。这些结果为学生实验时模拟血清的配制时间和贮存条件提供了参考。

　　值得一提的是，在糖尿病患者、肾病综合征患者模拟血清的制备过程中，TG标准液的水溶性较低，所以测定的稳定性稍显不足。但是，因为加入量较少，分散度尚可，所以仍可以检测到高于正常值的TG含量，可以满足实验教学的基本要求。另外，对于含有多个指标的模拟血清，各指标均未检测到理论添加的浓度，其原因可能与各生化指标之间互相干扰有关。还有，笔者也曾尝试在糖尿病、高甘油三酯血症和肾病综合征模拟血清中加入胆固醇，从而体现这些疾病血中胆固醇升高的特征。但是由于溶解胆固醇固体的有机溶剂（如吐温、氯仿）会影响后续测定体系中的酶活性，因此无法取得准确的实验结果，需在以后的实验中进一步寻找改善方法。

　　总之，本研究确定了4种教学用模拟患者血清的制备方法，它们操作简便且成本低廉。所得模拟血清无传染性，具有临床生化指标特征，低温条件下保存稳定性良好，可充分满足生物化学实验教学的需要。

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