[摘要] 目的 观察糖尿病牙周炎条件下小鼠牙周组织中非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2（ptpn2）、核因子-κb（nf-κb）的表达与牙周组织破坏的关系。方法 将4周龄健康雄性c57bl/6j小鼠随机分为正常对照组（n组）、单纯牙周炎组（p组）及糖尿病牙周炎组（dp组），每组6只。采用口内接种牙龈卟啉单胞菌法在p组建立牙周炎模型，采用腹腔注射链脲佐菌素结合高脂高糖食物与口内接种牙龈卟啉单胞菌法在dp组建立糖尿病牙周炎模型。各组动物于p、dp组末次细菌接种4周后处死，通过体视显微镜观察牙槽骨形态和附着丧失面积，采用苏木精-伊红（he）染色法观察牙周附着丧失的高度，免疫组织化学法检测牙周组织中ptpn2与nf-κb的表达强度。结果 p、dp组牙槽骨的附着丧失面积和牙周附着丧失高度均高于n组（p<0.05），ptpn2的表达量低于n组（p<0.05），而nf-κb的表达量则高
于n组（p<0.01）。结论 在糖尿病牙周炎的发生发展过程中，nf-κb可能有促进作用，而ptpn2可能有抑制作用；
ptpn2的表达减少可能导致nf-κb表达增强而加重牙周组织破坏。
[关键词] 糖尿病； 牙周炎； 非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2； 核因子-κb
[中图分类号] r 781.4 [文献标志码] a [doi] .1000-1182.2012.06.009
有研究[1]显示：糖尿病患者罹患牙周炎时，其炎症反应较非糖尿病患者严重，进展迅速，易造成明显的牙周组织破坏。如何有效地预防和治疗糖尿病患者的牙周炎，是目前临床工作中的难点之一。患牙周炎时，过度的炎症反应是造成牙槽骨等牙周组织损害的重要原因之一。侵入牙周组织的细菌能激活核因子-κb（nuclear factor-κb，nf-κb）途径，导致多种炎性细胞的活化和炎症因子的过表达，促进炎症的发生发展，最终导致牙周组织破坏[2]。有研究[3]表明：非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2，ptpn2）在免疫、炎症反应的信号转导中具有重要的调节作用，其表达水平降低与一些免疫、炎症性疾病的发生发展密切相关。在糖尿病牙周炎条件下，牙周组织中ptpn2和nf-κb的表达与牙周组织破坏有何种关系，国内外的研究还较少。本文通过观察实验性糖尿病牙周炎小鼠模型牙周组织中ptpn2、nf-κb的表达与牙周组织破坏的关系，探讨ptpn2、nf-κb蛋白在糖尿病牙周炎中参与牙周组织损害的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验试剂和仪器
链脲佐菌素（streptozotocin，stz）购自美国sigma公司；ptpn2兔抗多克隆抗体（biotech公司，美国），nf-κb鼠抗单克隆抗体（santa cruz公司，美国）；
sp试剂盒、dab显色试剂盒（北京中杉
金桥生物技
术有限公司）；体视显微镜（olympus公司，日本），
nikon 80i型显微镜（nikon公司，日本），2035型切
片机（leica公司，德国）。
1.2 动物分组及牙周炎小鼠模型的构建
4周龄16～18 g的健康雄性c57bl/6j小鼠18只（四川大学动物中心提供），随机分为3组：正常对照组（n组）、单纯牙周炎组（p组）及糖尿病牙周炎组（dp组），每组6只。n组按无特定病原体（specific patho-
gen free，spf）级动物常规饲养，不做任何处理。dp组喂饲高脂高糖食物，并按55 mg·kg-1腹腔注射stz，每天1次，连续注射5 d；末次注射1周后检测血糖，若血糖≥16.65 mmol·l-1确认糖尿病动物模型建立成功[4]。确认建模成功1周后，各组小鼠均给予正常饮食。p、dp组在1%戊巴比妥钠麻醉下通过口内涂布的方
式接种牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis，
alis）建立牙周炎模型。p. gingivalis的密度为
1×109 cfu·ml-1，接种0.05 ml，连续接种5次，隔日接种。接种菌液由保存菌种p. gingivalis atcc 33277活化增菌后，挑取平板上活的单个菌落，用加入2%羟甲基纤维素的无菌pbs配成密度为1×109 cfu·ml-1的
菌悬液。接种时在小鼠每个后牙的龈沟内涂布菌液。末次接种4周后处死各组小鼠（处死动物前再次检测血糖确定dp组小鼠血糖值≥16.65 mmol·l-1），取上下颌组织进行观察；将上颌组织进行常规固定、脱钙、石蜡包埋，制作切片；分离下颌软组织，洗净下颌骨，干燥备用。
1.3 体视显微镜观察后牙牙槽骨的附着丧失面积
取各组小鼠下颌骨进行体视显微镜检查，在
大15倍情况下计算全部后牙牙槽骨的附着丧失面积，即所有后牙牙槽嵴顶到釉牙骨质界之间的面积。
1.4 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，he）染色观察
牙周附着丧失的高度
取上颌组织沿第二磨牙颊舌向连续切片，he染色，镜下观察牙周组织病损情况，计算第二磨牙颊、舌侧牙周组织附着丧失高度（即牙周袋底部至釉牙骨
质界之间的高度）并取均值作为该牙的附着丧失高度。
1.5 免疫组织化学染色观察ptpn2和nf-κb的表达
取上颌组织切片进行免疫组织化学sp法染色，ptpn2兔抗多克隆抗体（1∶100）、nf-κb鼠抗单克隆抗体（1∶100）为一抗，pbs代替一抗作为空白对照。
ptpn2、nf-κb阳性信号为细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒。每个标本选取具有较明显牙周炎病理表现的3张切片，每张切片在100倍视野下选取着色最强的区域，换至400倍光镜下随机选取5个视野拍摄
照片，应用image pro-plus图像分析软件测量每张切片的平均光密度值（average optical density，aod）。
1.6 统计学分析
所得数据经spss 13.0软件进行处理，结果用x±s表示，组间差异采用完全随机设计单因素方差分析和snk-q检验，检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 体视显微镜观察结果
体视显微镜下，下颌后牙牙槽骨附着丧失面积的测量结果见表1，其形态学变化见图1。
由表1可见：n组的附着丧失面积低于p和dp组，其差异有统计学意义（p<0.05）；p组和dp组附着丧失面积的差异无统计学意义（p>0.05）。由图1可见：n组牙槽骨形态较正常，未出现明显骨吸收（图1a）；p、dp组可见牙槽嵴顶高度降低，牙槽骨表面有骨吸收陷窝，根分叉暴露（图1b、c）。
2.2 he染色结果
采用he染色观察上颌牙槽骨的形态学变化见图2，其附着丧失高度的测量结果见表1。由图2可见：
n组附着丧失很少（图2a）；p、dp组有牙周袋形成，上皮钉突增生成网状，牙周组织中有慢性炎细胞浸润（图2b、c）。由表1可见：n组的附着丧失高度小
于p和dp组（p<0.05），而p和dp组附着丧失高度的差异无统计学意义（p>0.05）。
2.3 免疫组织化学染色结果
3组的免疫组织化学染色情况见图3，其aod测量结果见表1：ptpn2蛋白在正常牙龈上皮细胞、牙周结缔组织细胞的细胞质与细胞核中均有表达，在n组的表达强度高于p组及dp组（p<0.05），而p组和
dp组表达的差异无统计学意义（p>0.05）；nf-κb表达于牙周组织细胞的细胞质与细胞核中，在n组的表达强度明显低于p组及dp组（p<0.01），而p组和dp组表达强度的差异无统计学意义（p>0.05）。
3 讨论
牙周炎是主要的口腔疾病之一，在糖尿病患者中具有较高的发病率，是糖尿病的第六大并发症。因其常导致严重的附着丧失与骨吸收，极大地影响患者的生活质量，所以糖尿病牙周炎的发生发展机制及防治手段在牙周疾病研究中倍受关注。
患有糖尿病时，宿主对病原微生物产生的过度炎症反应是造成牙周组织破坏的重要原因。作为一种真核细胞转录因子，nf-κb的激活与多种炎症性疾病密切相关。在正常生理情况下，nf-κb常与其抑制蛋白（inhibitor κb，i-κb）家族成员结合，以无活性复合物的形式存在于细胞中；当病原微生物及其产物如内毒素等细胞外信号作用于细胞时，可激活相应受体将信号传导入细胞内，使i-κb磷酸化并与nf-κb解离，导致nf-κb进入细胞核内与特异的dna序列结合，调节靶基因转录和表达，促进炎症的发生发展[5]。有学者[6]发现：牙周炎患者牙周组织
细胞的细胞核及细胞质中nf-κb的激活率远高于正常组织；在另外的研究[7-8]中发现：牙周致病菌p. gin-
givalis侵入牙龈上皮细胞时会激活nf-κb途径，引起白细胞介素等炎症因子的生成增加，并可趋化中性粒细胞等炎细胞到感染部位，引发炎症反应。此外，nf-κb可抑制中性粒细胞等炎细胞的正常凋亡，使其死亡从而崩解释放多种破坏牙周组织的酶，增强炎症反应[2]。已有研究[9]发现：nf-κb与糖尿病状态
下的炎症损伤调节有重要的关系，降低nf-κb的水平可有效改善糖尿病患者神经系统的炎性病变。本实验结果显示：与正常对照组相比，糖尿病牙周炎小鼠的牙周组织有明显的附着丧失，出现牙周袋及炎细胞浸润，且nf-κb表
达增强。其可能机制为细菌感染牙周组织时，牙龈成纤维细胞、巨噬细胞等细胞的nf-κb途径被激活，引起白细胞介素、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，tnf-α）等炎症因子释放，趋化并活化炎症细胞，释放更多的炎性介质，致使炎症反应加剧并加重组织损伤，如诱导结缔组织间质细胞产生基质金属蛋白酶使间质中的胶原降解，刺激基质细胞凋亡限制牙周组织修复，促进破骨细胞分化及骨吸收等[10-11]。有学者[12]发现，在糖尿病条件下，巨噬细胞、中性粒细胞等细胞对细菌释放的内毒素的反应更为敏感，能释放更多的炎症因子，并使炎症反应延长，这能促进糖尿病并发的炎症反应出现严重的破坏且进展迅速。本实验中，dp组小鼠的牙周附着丧失量、nf-κb表达量的测量值与p组的差异无统计学意义，可以考虑在下一步实验中采用micro ct、实时荧光聚合酶链反应、免疫印迹法等灵敏度更高的方法进一步检测组间的差异。
ptpn2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成员，有两种mrna编辑方式：一种编码形成相对分子质量为4.8×104的蛋白质，称为tc48，定位于内质网和高尔基复合体；另一种编码形成相对分子质量为4.5×104的蛋白质，称为tc45，定位在细胞核内[3]。tc45发
挥主要的生物学作用，当细胞受到刺激后，tc45游离出细胞核，使细胞质内的蛋白质，如表皮生长因子受体、蛋白酪氨酸激酶（janus kinase，jak）、信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of
transcription，stat）等去磷酸化，抑制下游信号通路的转导，调节炎症和免疫反应[3]。在敲除ptpn2的动
物模型体内，血清中肿瘤坏死因子等炎症介质的水平升高，并出现广泛而严重的炎症性疾病[13]。本实
验发现，dp组和p组小鼠的牙周组织中出现明显的组织破坏及炎症反应，同时ptpn2的表达低于n组，提示ptpn2的表达水平下降可能是造成牙周炎症反应加剧及组织损伤的原因之一。可能机制是ptpn2能抑制巨噬细胞产生tnf-α，并与肿瘤坏死因子受体相关因子-2相互作用，抑制tnf-α介导的炎症反应；它能使集落刺激因子-1受体及src酪氨酸激酶去磷酸化，进而调节erk信号转导通路，抑制单核细胞的增殖、分化与炎性反应；它可降低jak的酪氨酸磷酸化程度，并可使stat上的酪氨酸去磷酸化以调节stat的活性，进一步下调jak/stat信号通路的传导，从而抑制干扰素-γ、白细胞介素-6介导的基因表达与炎症反应，减少组织损害[14-15]，而ptpn2表达减少时，这些作用减弱，可以加速牙周组织的破坏。
本实验显示，与正常小鼠相比，糖尿病牙周炎
与单纯牙周炎小鼠的牙周组织中ptpn2表达减少，
同时nf-κb表达增高，提示ptpn2可能通过调节nf-κb的表达影响牙周炎的进程，其机制可能是ptpn2表达下降，抑制巨噬细胞分泌tnf-α以及抑制tnf-α介导的炎症反应作用减弱，而tnf-α可以促使中性粒细胞活化并释放活性氧，使i-κb磷酸化并激活nf-κb信号转导通路，进而加重炎症反应及组织破坏[16]。
综上所述，本实验观察到糖尿病牙周炎时牙周组织中nf-κb表达增强，ptpn2表达减弱，提示在糖尿病牙周炎的发生发展过程中，nf-κb可能有促进作用，ptpn2可能有抑制作用，且ptpn2的表达水平下降可能导致nf-κb表达增多而加重牙周组织的破坏。了解这些因子相互作用的机制及其与牙周破坏之间的关系，有助于为今后寻找糖尿病牙周炎的防治措施提供新思路。
[参考文献]
[1] lakschevitz f， aboodi g， tenenbaum h， et al. diabetes and pe-
riodontal diseases： interplay and links[j]. curr diabetes rev， 2011，
7（6）：433-439.
[2] 欧阳玉玲， 吴亚菲. 核转录因子-kappa b与牙周炎[j]. 国际口腔
医学杂志， 2007， 34（5）：345-347.
ouyang yuling， wu yafei. nuclear factor-kappa b and periodo-
ntitis[j]. int j stomatol， 2007， 34（5）：345-347.
[3] bourdeau a， dubé n， tremblay ml. cytoplasmic protein tyrosine
phosphatases， regulation and function： the roles of ptp1b and
tc-ptp[j]. curr opin cell biol， 2005， 17（2）：203-209.
[4] 付永伟， 和红兵， 欧炯光. 实验性糖尿病牙周炎诱导成骨细胞凋
亡的研究[j].
华西口腔医学
杂志， 2009， 27（3）：252-255， 259.
fu yongwei， he hongbing， ou jiongguang. osteoblast apoptosis
in experimental diabetic periodontitis in rats[j]. west china j sto-
matol， 2009， 27（3）：252-255， 259.
[5] 朱建华， 苗琳， 马术明， 等. 核因子-κb在不同时期糖尿病大鼠
模型颌下腺表达的研究[j]. 口腔
医学研究， 2011， 27（11）：941-
943， 947.
zhu jianhua， miao lin， ma shuming， et al. expression of nuclear
factor-κβ in different periods diabetic rats’ submandibular gland
model[j]. j oral sci res， 2011， 27（11）：941-943， 947.
[6] ambili r， santhi ws， janam p， et al. expression of activated
transcription factor nuclear factor-kappa b in periodontally di-
seased tissues[j]. j periodontol， 2005， 76（7）：1148-1153.
[7] kusumoto y， hirano h， saitoh k， et al. human gingival epithe-
lial cells produce chemotactic factors interleukin-8 and monocyte
chemoattractant protein-1 after stimulation with porphyromonas
gingivalis via toll-like receptor 2[j]. j periodontol， 2004， 75（3）：
370-379.
[8] chung wo， hansen sr， rao d， et al. protease-activated recep-
tor signaling increases epithelial antimicrobial peptide expression
[j]. j immunol， 2004， 173（8）：5165-5170.
[9] negi g， kumar a， sharma ss. nrf2 and nf-κb modulation by
sulforaphane counteracts multiple manifestations of diabetic neuro-
pathy in rats and high glucose-induced changes[j]. curr neurovasc
res， 2011， 8（4）：294-304.
[10] brechter ab， persson e， lundgren i， et al. kinin b1 and b2 re-
ceptor expression in osteoblasts and fibroblasts is enhanced by
interleukin-1 and tumour necrosis factor-alpha. effects dependent
on activation of nf-kappab and map kinases[j]. bone， 2008， 43
（1）：72-83.
[11] wisutsitthiwong c， buranaruk c， pudhom k， et al. the plant li-
monoid 7-oxo-deacetoxygedunin inhibits rankl-induced osteo-
clastogenesis by suppressing activation of the nf-κb and mapk
pathways[j]. biochem biophys res commun， 2011， 415（2）：361-
366.
[12] furudoi s， yoshii t， komori t. balance of tumor necrosis factor
alpha and interleukin-10 in a buccal infection in a streptozotocin-
induced diabetic rat model[j]. cytokine， 2003， 24（4）：143-149.
[13] heinonen km， bourdeau a， doody km， et al. protein tyrosine
phosphatases ptp-1b and tc-ptp play nonredundant roles in
macrophage development and ifn-gamma signaling[j]. proc natl
acad sci u s a， 2009， 106（23）：9368-9372.
[14] van vliet c， bukczynska pe， puryer ma， et al. selective regula-
tion of tumor necrosis factor-induced erk signaling by src family
kinases and the t cell protein tyrosine phosphatase[j]. nat im-
munol， 2005， 6（3）：253-260.
[15] chistiakov da， chistiakova ei. t-cell protein tyrosine phospha-
tase： a role in inflammation and autoimmunity[j]. int j diabetes
mellit， 2010， 2（2）：114-118.
[16] gloire g， legrand-poels s， piette j. nf-kappab activation by reac-
tive oxygen species： fifteen years later[j]. biochem pharmacol，
2006， 72（11）：1493-1505.
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