6种草本药用植物种子超低温保存技术研究

      超低温冷冻保存指将材料放置在低于-80 ℃的环境中保存，通常是用液氮（-196 ℃）作为贮藏源，大多数的植物种质在液氮中新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”状态[1]，可以达到长期保存的目的。因此已被广泛应用于生物种质的长期保存，应用范围也在不断扩大[2]。目前超低温冷冻保存已成功应用于植物材料、动物干细胞、鱼虾精细胞、微生物等的保存。其中植物材料包括种子、悬浮细胞[3]、愈伤组织[4]、胚[5-6]、花粉[7]、茎尖分生组织[8]、芽等。国内外针对药用植物种子超低温保存的研究不多，李海兵等[9]对怀山药种质、何明高等[10]对束花石斛种子、任淑娟等[11]对七叶树种子、Hirano等[12]对白芨种子进行了超低温保存，在药用植物种质超低温保存方式、种子含水量、化冻方式对超低温保存后种质存活率的影响取得了成果。 
　　草本植物是区别于木本植物的一类植物的总称，包括重要的粮食如小麦、玉米等，且有很多草本植物是中药材的重要来源，例如黄芪、夏枯草、人参等。本研究对具有药用价值的杜若、过江藤、夏枯草、皱果苋、罗勒和山香等6种草本药用植物种子进行超低温保存研究，对这些药用植物种子超低温保存的可行性和技术方法进行了探讨，为具有药用价值的草本植物的保护性开发提供技术。 
　　1 材料与方法 
　　1.1 材料 
　　供试材料来自海南和广东的草本植物杜若、过江藤、夏枯草、皱果苋、罗勒和山香种子，由国家南药基因资源库提供（表1）。 
　　1.2 方法 
　　1.2.1 种子含水量测定 根据《国际种子检验规程》（ISTA编，1999）采用高温烘干法测定种子含水量（ω0），烘干温度（103±2）℃，烘干时间16 h。ω0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。 
　　1.2.2 种子干燥 采用硅胶干燥法。将种子放入盛有硅胶的干燥器中，根据自然含水量经不同時间干燥分别获得含水量为13.50%（自然含水量）、11.90%、9.68%、7.89%和5.71%的杜若种子，含水量为11.20%（自然含水量）、10.69%、9.69%、8.44%和8.10%的过江藤种子，含水量为10.63%（自然含水量）、9.88%、8.02%和6.99%的夏枯草种子，含水量为16.18%（自然含水量）、13.88%、12.75%、10.67%和8.56%的皱果苋种子，含水量为26.33%（自然含水量）、20.87%、18.18%、13.86%和7.78%的罗勒种子和含水量为12.82%（自然含水量）、9.09%、7.63%、5.45%和4.55%的山香种子。

      1.2.3 种子发芽方法 参照《国际种子检验规程》的规定。各试验4个重复，每重复40粒。计算出种子（种胚）的发芽率=种子发芽数/实验种子数×100%。 
　　1.2.4 超低温保存方法 目前使用的液氮超低温保存方法主要有：缓慢冷冻法、直接冷冻法、玻璃化冷冻法、包埋脱水冷冻法、包埋玻璃化冷冻法等。根据实际情况，本实验选用缓慢冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法对6种草本药用植物种子进行液氮超低温保存实验。 
　　缓慢冷冻法：将种子放入加有保护液（PVS2）（室温）的冻存管中，置于4 ℃冰箱中0.5 h，取出立即放入-20 ℃冰柜中1 h，1 h后迅速投入液氮中保存。PVS2：30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亚砜+0.4 mol/L蔗糖。 
　　直接冷冻法：将种子放入冻存管中直接投入液氮中保存。 
　　玻璃化冷冻法：将种子放于装载液（LS）中室温处理20 min后，转入PVS2进行30 min的冰水浴处理。冰水浴处理后将种子转移至装有预冷新鲜PVS2的冻存管中，迅速投入液氮中保存。LS：含2 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的MS液体培养基。 
　　解冻：取出液氮中冻存48 h的冻存管，室温化冻5 min。 
　　洗涤：将解冻后的种子在室温下用洗涤液（US）洗涤2～3次，每次5～10 min，再用无菌水洗涤2～3次，每次5～10 min。US：含有1.2 mol/L蔗糖的MS培养液。 
　　恢复培养：洗涤后的种子在滤纸上吸干后，转移至发芽盒， 25～30 ℃、70%RH条件下培养。 
　　1.3 数据分析 
　　数据采用SAS软件和Excel（2016）软件进行统计分析。 
　　2 结果与分析 
　　2.1 超低温保存对种子发芽率的影响 
　　超低温保存种子效果的判定一般采用测定发芽率的方法，以种子进入液氮一段时间取出后有一定的发芽率来判定保存方法的成功与否[22]。本实验6种草本药用植物种子经液氮处理后都有一定的发芽率，具体结果见表2。从表2可以看出，液氮超低温冷冻对草本药用植物种子发芽率影响不同，与对照组相比，其种子平均发芽率有降低的，也有提高的。经3种不同冷冻方式处理冷冻后，杜若、夏枯草和皱果苋种子发芽率与对照相比，差异不显著（p>0.05）；罗勒和山香种子其种子平均发芽率降低了15%～70%不等，其中降低幅度最大的是罗勒种子；过江藤种子平均发芽率由原来的61%提高至65.52%。 
　　2.2 含水量对种子发芽率的影响 
　　根据种子贮藏特性可将种子分为两类，一类为耐脱水和低温的正常性种子，另一类为不耐脱水和低温的顽拗性种子[23]。由图1可知，过江藤种子发芽率随着含水量的下降而有所降低，从72.58%降至54.49%；而含水量的下降对杜若、夏枯草、皱果苋、山香和罗勒种子发芽率的影响不大，种子含水量低于10%时其发芽率均在70%以上。这表明过江藤种子不耐脱水干燥，杜若、夏枯草、皱果苋、山香和罗勒种子可脱水干燥。 
　　超低温冷冻过程中，种子的含水量是影响其生命力的一个关键因素。理论上讲，含水量过高会使种子在冷冻和解冻过程中受到伤害甚至死亡，过低又会造成脱水伤害影响其活力[24]。本研究结果（图1和表2），含水量5.71%～13.50%的杜若种子和8.56%～16.18%的皱果苋种子经液氮超低温冷冻后，其种子发芽率与对照相比，差异不显著（p>0.05），且平均发芽率均在80%以上。液氮冷冻后的过江藤种子，除含水量9.69%外，其他含水量下的种子发芽率随含水量的下降而急剧降低，与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。夏枯草种子含水量在6.99%～8.02%时，液氮冷冻后的种子发芽率较对照组下降明显，含水量为9.88%～10.63%时，与对照组相比，液氮冷冻后的种子发芽率有所增加，这表明夏枯草种子超低温冷冻的最佳含水量为8.02%。含水量5.45%～12.82%的山香种子，液氮超低温处理前后其发芽率均存在显著差异（p<0.05），且含水量低于7.63%的山香种子对照组发芽率随含水量的下降而降低，冷冻组发芽率高于其它含水量，由此表明7.63%为山香种子液氮超低温冷冻的最佳含水量。 罗勒种子含水量在7.78%～26.33%范围时，液氮冷冻后其种子发芽率较对照组均存在极显著差异（p<0.01）；含水量26.33%的罗勒种子冷冻后其发芽率几乎为0，随着含水量的下降，其冷冻组发芽率显著提高。 
　　2.3 冷冻方式对超低温保存的影响 
　　超低温冷冻方式是液氮冷冻过程中影响种子活力的重要因素。常用的超低温冷冻法有玻璃化冷冻、直接冷冻、缓慢冷冻、包埋冷冻等[25]，直接冷冻法能节约实验成本，缩短实验时间，且没有化学物质的伤害，但不是所有的种质都适用于这个方式[26]。玻璃化溶液处理是缓慢冷冻法和玻璃化冷冻法的关键，玻璃化溶液中含有冷冻保护剂，易形成玻璃化状态，并且很容易进入植物组织中，一旦快速冷冻时，植物组织形成玻璃化状态，进一步使组织脱水，可以减轻伤害，提高存活率[27]。本研究采用了玻璃化冷冻、缓慢冷冻和直接冷冻3种冷冻方式对6种不同含水量范围的草本药用植物种子进行液氮超低温冷冻，由表2显示结果如下。 
　　含水量5.71%～13.50%的杜若种子，经液氮超低温冷冻后其种子发芽率较对照相比虽有差异，但变化幅度不大，平均发芽率都在80%以上，其中缓慢冷冻组和直接冷冻组的發芽率显著高于玻璃化冷冻组。 
　　含水量8.10%～11.20%的过江藤种子，液氮冷冻后，其缓慢冷冻组和直接冷冻组的种子发芽率随含水量的降低而急剧下降，特别是含水量为8.44%时的直接冷冻组和含水量8.10%时的缓慢冷冻组，其发芽率均由55%降至27%左右，降低幅度最大；含水量由11.20%降至10.69%时，玻璃化冷冻组的种子发芽率由对照的66.67%降至57.14%，而含水量在8.10%～9.69%之间时，玻璃化冷冻组的种子发芽率均高于对照组。结果表明，过江藤种子液氮超低温冷冻试验中，玻璃化冷冻法优于缓慢冷冻法和直接冷冻法。

      夏枯草种子含水量在6.99%～8.02%时，液氮冷冻后的种子发芽率较对照组有所下降，含水量6.99%的玻璃化冷冻组由75.76%降至45.83%，降低幅度最大；含水量在9.88%～10.63%时，液氮冷冻后的种子发芽率较对照组增加了，其中含水量10.63%的缓慢冷冻组增加幅度最大。结果显示，缓慢冷冻后的种子平均发芽率显著高于玻璃化冷冻和直接冷冻。 
　　含水量为8.56%～16.18%的皱果苋种子，液氮超低温冷冻后其种子发芽率虽有增加或降低，但变化幅度不大，平均发芽率都在82%以上，其中缓慢冷冻组的种子平均发芽率显著高于玻璃化冷冻组和直接冷冻组。 
　　山香种子含水量在4.55%～12.82%时，冷冻组的种子发芽率较对照组相比均下降了15%左右，其中含水量为9.09%时，冷冻后的种子发芽率低至60%，下降幅度最大；且玻璃化冷冻的种子平均发芽率显著高于缓慢冷冻组和直接冷冻组。 
　　罗勒种子含水量在7.78%～26.33%范围时，液氮冷冻后其种子发芽率均有不同程度的下降，其中玻璃化冷冻组和缓慢冷冻组的种子发芽率甚至降为0；结果表明，直接冷冻法更适合于罗勒种子超低温保存。 
　　3 讨论 
　　有研究表明，液氮超低温冷冻有促进种子萌发的作用，王荷等[22]在对25种野生花卉种子进行液氮超低温保存实验中发现，有12种野生花卉种子经液氮冷冻后其发芽率显著提高了。在本研究中，也有观察到，含水量13.50%的杜若种子缓慢冷冻和直接冷冻后的发芽率高于对照组；含水量11.20%的过江藤种子和含水量16.18%、12.75%的皱果苋种子经玻璃化冷冻和缓慢冷冻后，其种子发芽率高于对照组；含水量在9.88%～10.63%的夏枯草种子经液氮冷冻后，种子发芽率高于对照组；含水量在13.86%～18.18%的罗勒种子经直接冷冻后，其种子发芽率高于对照。有可能是液氮冷冻打破了种子的休眠，也有可能是保护剂中的化学物质的刺激[28]，具体机理还有待进一步研究。 
　　种子只有在适宜的含水量范围内才能有效进行超低温保存，降香黄檀种子超低温冷冻的最适含水量范围为10.54%～12.35%[24]，高良姜种子超低温冷冻的最适含水量范围为12.78%～13.58%[26]，白木香种子超低温冷冻的最适含水量为7.35%[29]。本研究所试的6种草本药用植物中，除罗勒外，其余5种草本药用植物均实现了自然含水量下的超低温保存，表明这5种草本药用植物种子自然含水量在液氮超低温保存的安全含水量范围内；而将自然含水量下的罗勒种子经不同时间干燥后，获得7.78%～20.87%含水量范围内的罗勒种子也成功实现了超低温保存。表明多数草本药用植物种子自然含水量在超低温冷冻保存的安全含水量范围之内，需进一步扩大种类加以验证。 
　　我们承建的针对中药材种质超低温保存库——国家南药基因资源库，已于2015年初投入使用，并保存有400多种药用植物种子。本研究成功地对杜若种子、过江藤种子、夏枯草种子、皱果苋种子、山香种子和罗勒种子等6种草本药用植物种子进行了液氮超低温保存，这将为中药材种子的超低温保存提供借鉴，为超低温库的建设提供理论基础，有利于解决药用植物种子批量入库长期有效保存的问题，对推动我国药用植物种质资源安全保护起到积极作用。 
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