组织微阵列方法检测CD31、CD105、v-WF、PCNA在肝癌组

【摘要】 ［目的］ 探讨mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna的表达与肝癌生物学行为的关联。［方法］ 构建包含38例肝癌及癌旁组织的组织微阵列，以免疫组织化学方法检测mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna的表达，同期应用免疫荧光双染色法检测cd31及pcna表达。［结果］ 肝癌组织mvd-cd31均值为48.5±29.7，而癌旁组织mvd-cd31均值为24.2±22.3，差异有显著性（p＜0.01）；pcna高表达的肝癌组织mvd-cd31均值（68.3±36.9）显著高于pcna低表达的肝癌组织（37.9±30.9，p=0.012）。mvd-cd105及mvd-v-wf在肝癌组织及癌旁组织分别为22.4±12.3和15.9±11.7；21.5±13.3和34.0±16.7，差异无显著性。存在肝内转移的肝癌组织mvd-cd105均值为28.4±19.4,而无肝内转移的肝癌组织mvd-cd105均值为5.4±5.2，差异有显著性（p＜0.01）；存在肝内转移的肝癌组织及无肝内转移的肝癌组织mvd-cd31及mvd-v-wf分别为66.6±39.4和44.9±32.9；25.2±15.2和19.7±9.9，差异无显著性。［结论］ mvd-cd31与肝癌增殖状态相关，mvd-cd105与肝癌肝内转移相关，肿瘤新生血管可能在肝癌发生演进过程中起重要作用。

【关键词】 肝肿瘤

新生血管形成是肿瘤生长、转移的前提，目前，作为多种肿瘤预后标志的肿瘤组织微血管密度（microvessel density，mvd）受到广泛关注[1]。通过染色内皮细胞标志分子反映肿瘤血管是目前常用的技术手段。研究表明，不同内皮标志分子反映肿瘤血管能力并不相同，与临床参数关联亦存在差异；同一内皮标志分子在不同肿瘤中，也可能具有不同的意义[2]。因而，研究不同肿瘤的内皮细胞标志分子与肿瘤生物学行为的关联，对选择有效反映肿瘤组织微血管的内皮标志分子有指导意义。血管播散为肝癌的主要转移形式，不同血管标志分子，如cd31、cd105、v-wf与肝癌生物学行为是否存在关联尚不明晰。组织微阵列是快速、均匀检测众多样本蛋白表达的技术[3]。我们采用组织微阵列技术研究了mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna在38例肝癌标本中的表达，初步探讨它们表达与肝癌临床病理参数之间的关联性。

1 材料与方法

38例肝癌根治性切除组织标本，为我院1999~2004年收治的患者。平均年龄64岁，女性7例，男性31例。平均肿瘤大小6.6cm，其中13例小于3cm，38例患者中，丙型肝炎感染者27例，乙型肝炎者6例。新鲜组织标本10%福尔马林固定，石蜡包埋。

1.1 肝癌组织微阵列的构建

应用tissue arrayer(beecher instvumeuts znc)构建肝癌组织微阵列，操作按说明书进行，直径为2mm。在he切片上选择合适的肿瘤区域，避免坏死区域。每例组织，分别选择肿瘤中心部位、肿瘤与肝组织交界部位及残留非癌肝组织部位，各例组织制作组织学芯片。切取4μm切片供he染色和免疫组织化学检测用。

1.2 cd31、cd105、v-wf及pcna免疫组织化学染色

系列组织微阵列分别与cd31、cd105、v-wf及pcna单克隆抗体（dako，denmark）进行免疫组织化学染色。免疫组化sp法，选择pbs作为阴性对照。

1.3 结果判定

1.3.1 mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf表达

微血管密度(mvd) 测定参照weidner[4]的微血管计数方法：首先，于低倍镜(×40) 下观察全部视野，选择3 个富含管组织的“热点”区，即棕黄染色密度最高的区域。然后，在高倍镜(×400)下双盲法计数微血管。呈现单个或聚集在一起的数个被染为棕黄色或棕褐色的内皮细胞，独立于邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织，作为1个微血管计数，计数3个视野，取其均值作为mvd。管腔大于8 个红细胞直径或管壁带有肌层的大血管不作为新生血管计数。

1.3.2 pcna表达

核染色阳性细胞与计数细胞之比称为pcna阳性细胞率：＜1%为0；1%~20%为1；21%~50%为2；＞50%为3。2与3为pcna高表达。

1.4 cd31及pcna的免疫荧光双染色

组织微阵列二甲苯脱蜡，柠檬酸缓冲液加热修复抗原。4℃ 1∶50稀释的鼠抗人pcna单克隆抗体孵育18h。pbs 冲洗5min，2次。然后与1∶200稀释的共轭联连fitc的免抗鼠igg抗体（dako denmark）闭光37℃孵育30min[5]，pbs冲洗，柠檬酸缓冲液加热15min，pbs冲洗。然后组织微阵列与1∶40稀释的鼠抗人单克隆抗体37℃孵育1h，pbs冲洗，再与1∶200稀释的共轭联连cy3的免抗鼠单抗igg 37℃孵育30min；pbs冲洗5min，2次。

1.5 统计学处理

利用t检验与χ2检验分析患者临床及病理参数与mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna表达的相关性。利用 systat softwave (version 10.2)进行统计学分析。p值小于0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 cd31、cd105、v-wf、pcna免疫组织化学染色

⑴cd31、cd105、v-wf免疫组织化学染色

cd31在上皮细胞的胞浆/胞膜表达，肝癌组织cd31免疫染色的血管多于癌旁组织(图1)。cd105在上皮细胞的胞浆/胞膜表达，存在肝内转移的肝癌组织cd105免疫染色的血管多于无肝内转移的肝癌组织（图2）。v-wf在上皮细胞的胞浆/胞膜表达，肝癌组织v-wf免疫染色的血管数量与癌旁组织无差异。肝癌组织mvd-cd31均值为48.5±29.7，而癌旁组织mvd-cd31均值为24.2±22.3，差异有显著性（p＜0.01）；mvd-cd105及mvd-v-wf在肝癌组织及癌旁组织分别为22.4±12.3和15.9±11.7；21.5±13.3和34.0±16.7，差异无显著性（表1）。

pcna在肝癌细胞核中表达，肝癌组织免疫染色显著多于癌旁组织(表1)。

⑵肝癌组织mvd-cd31，mvd-cd105 及mvd-v-wf与pcna表达的关系

pcna高表达的肝癌组织mvd-cd31均值（68.3±36.9）显著高于pcna低表达的肝癌组织（37.9±30.9，p=0.012），mvd-cd105及mvd-v-wf与pcna表达无相关性（图3）。

⑶存在肝内转移的肝癌组织及无肝内转移的肝癌组织的mvd-cd31，mvd-cd105及mvd-v-wf

存在肝内转移的肝癌组织mvd-cd105均值为28.4±19.4，而无肝内转移的肝癌组织mvd-cd105均值为5.4±5.2，差异有显著性（p＜0.01）；存在肝内转移的肝癌组织及无肝内转移的肝癌组织mvd-cd31及mvd-v-wf分别为66.6±39.4和44.9±32.9；25.2±15.2和19.7±9.9，差异无显著性（表1）。

2.2 cd31及pcna在肝癌组织的免疫荧光双染色

红色免疫荧光染色为cd31；绿色免疫荧光染色为pcna。由图4可见，pcna高表达的肝癌组织mcd-cd31分值高。

2.3 mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna表达与临床病理参数关系

mvd-cd105在存在肝内转移的肝癌表达显著增高（p＜0.01）；而mvd-cd31、mvd-v-wf及pcna表达与肝癌的肝内转移无相关性，它们与其它临床参数，如年龄、性别、肿物大小、组织学分级、静脉浸润未见相关性（表1）。

3 讨 论

新生血管的启动是肿瘤演进过程中的早期事件，不仅为肿瘤组织提供营养支持，也是肿瘤细胞进入循环系统的途径；相对于成熟血管，肿瘤细胞更容易进入基底膜发育不完全的新生血管[5]。研究证实，肿瘤新生血管的微血管密度与进入循环系统的肿瘤细胞数量关系密切。目前，作为多种肿瘤预后标志的肿瘤组织微血管密度受到广泛关注[1]。通过染色内皮细胞标志分子反映肿瘤血管是目前常用的技术手段。研究表明，不同内皮标志分子反映肿瘤血管能力并不相同，与临床参数关联亦存在差异；同一内皮标志分子在不同肿瘤中，也可能具有不同的意义[2]。因而，研究不同肿瘤的内皮细胞标志分子与肿瘤生物学行为的关联，对选择有效反映肿瘤组织微血管的内皮标志分子有指导意义。cd31、cd105、v-wf是常见的内皮细胞标志分子，研究显示，它们在肿瘤组织中表达的意义并不一致[6,7]，它们与肝癌肝内转移是否存在关联尚不明晰。组织微阵列是快速、均匀检测众多样本基因蛋白表达的技术[3]。我们采用组织微阵列技术研究mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna在38例肝癌标本中的表达，探讨它们与肝癌临床参数的关联。

cd31作为内皮细胞标志，在非成熟的肿瘤血管及成熟血管中均有表达，相对于其他内皮细胞标志，mvd-cd31更能精确反映肿瘤血管数量[8]。我们发现肝癌组织mvd-cd31均值（48.5±29.7）显著高于癌旁组织，mvd频率与messerini l等[9]研究接近（肝癌组织mvd-cd34的均值为54±13.8）。免疫荧光结果表明，肝癌组织cd31阳性血管明显多于癌旁组织，癌旁组织cd31阳性血管主要存于门静脉周围。pcna表达不同的肝癌组织mvd-cd31分值显著不同，两者呈正性相关；cd31及pcna免疫荧光双染色支持mvd-cd31分值高的癌组织，pcna高量表达。推测血管生成可能促进肝癌细胞的增殖，可能与肝癌的发生有关。mvd-cd31可能成为反映肝癌增殖状态的潜在指标。mvd-cd31与肝癌的肝内转移及其它临床参数，如年龄、性别、肿物大小、组织学分级、静脉浸润无相关性。

cd105可能通过tgf-βrⅰ和/或tgf-βrⅱ参与了tgf-β的信号传递过程，与血管生成调控关系密切；它仅表达于活性的内皮细胞，能更好反映恶性肿瘤的新生血管形成[10]。mvd-cd105为乳腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌独立的预后指标[11]，cd105有希望成为拮抗肿瘤血管生成治疗的有效靶位[12]。然而cd105在肝癌中表达的相关研究尚未见报道。cd105表达与肝癌的肝内转移是否存在关联尚不明晰。我们发现在肝癌组织和癌旁组织中mvd-cd105表达无差异，与pcna表达无相关性；mvd-cd105在存在肝内转移的肝癌组织中表达高于无肝内转移者，提示新生血管生成可能促进肝癌肝内转移，mvd-cd105可能成为反映肝癌肝内转移的有意义指标。我们发现cd105在癌旁组织显现弥散分布的染色方式，而癌旁组织多为非正常组织，cd105在癌旁组织表达的意义有待进一步研究。mvd-cd105与其它临床参数，如年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级、静脉浸润无相关性。

我们同时检测成熟血管标志物v-wf[7]，未发现mvd-v-wf与任何临床病理参数相关联。提示v-wf阳性血管可能多为既存血管，因此在肝细胞癌中v-wf的检测可能没有很大意义。

综上，我们应用组织微阵列检测肝癌组织mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna表达，初步探讨了它们与肝癌临床病理参数之间的关联，研究表明，mvd-cd31与肝癌增殖状态相关，mvd-cd105与肝癌肝内转移关系密切，是反映肝癌恶性生物学行为相关指标，肿瘤新生血管可能在肝癌发生演进过程中起重要作用。

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