阿霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制研究

　　阿霉素,又名14-羟基柔红霉素,为蒽环类抗生素，抗瘤谱较广，疗效高，是临床常用的抗肿瘤药物。除白血病外，其对膀胱癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲状腺癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、软组织肉瘤以及侵蚀性淋巴瘤等都有疗效[1].阿霉素抗肿瘤作用机制包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞周期以及使肿瘤细胞发生自噬等[2].文献报道，阿霉素可能通过影响 Bcl-2 / Bax[3]、JNK 凋亡通路[3]、p53 凋亡通路[4]以及激活腺苷酸活化蛋白激酶( AMPK)[5]等诱导细胞凋亡，但其确切机制仍未十分明了。

　　细胞凋亡早期出现的细胞容积减小称为凋亡性细胞皱缩( apoptoticvolume decrease,AVD) ,是具有普遍性意义的细胞凋亡早期的标志性事件。我们实验室前期研究表明，氯通道参与过氧化氢诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12 细胞凋亡[6]、紫杉醇[7]和丹参酮[8]诱导的低分化鼻咽癌 CNE-2Z 细胞的凋亡。这些结果提示多种抗肿瘤药物都可能通过激活氯通道引起 AVD,继而诱导细胞发生凋亡，从而发挥其抗癌作用。

　　本研究旨在探讨阿霉素是否通过激活细胞氯通道而诱导凋亡性细胞皱缩，从离子通道的角度来探讨阿霉素诱导 CNE-2Z 细胞凋亡的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1. 1 细胞培养 用含 10% 小牛血清、双抗( 1 × 105U·L- 1青霉素与 100 mg·L- 1链霉素) 的 RPMI1640生长液，在 37°C 恒温培养箱( 5% CO2、饱和湿度)内常规培养低分化鼻咽癌细胞( CNE-2Z) ,每两天传代 1 次。实验前取对数生长期的 CNE-2Z 细胞，用0. 25% 胰酶进行消化传代，收集、重悬细胞，将细胞悬液接种于直径 22 mm 的圆形玻片上，置入培养箱使细胞贴壁，待细胞贴壁 1 h 后进行实验。

　　1. 2 主要试剂与药品 盐酸阿霉素固体粉末购于上海生工生物有限公司，用二甲基亚砜( DMSO) 溶解，配制成浓度为 2. 5 mmol·L- 1的储存液，储存在4℃ 冰箱中，使用前稀释至终浓度。氯通道阻断剂5-nitro-2-( 3-phenylpropylamino) -benzoate ( NPPB) 购自 Sigma 公司，溶于 dimethyl sulfoxide( DMSO) 中，配成 100 mmol·L- 1的储存液，工作浓度为 100 μmol·L- 1.等渗灌流液组成( mmol·L- 1) : 10 HEPES,0. 5 MgCl2,70 NaCl,140 D-mannitol,2 CaCl2,用冰点渗透压计( Osmomat030,Gono2tec) 调节溶液渗透压至 300 mOsmol·L- 1,用 Tris-base 调节 pH 至 7. 4.1. 3 细胞容积测量 将贴有细胞的玻片置于灌流槽内，在倒置相差显微镜( IX71,Olympus,日本) 下选择固定视野，用图像分析软件( Image-Pro Plus 6.3,Media Cybernetics,USA ) 控 制 数 字 式 摄 像 机( RETIGA 4000R,QImaging,Canada) ,进行连续拍摄，每 2 min 拍摄一幅，直至 2 h.拍摄的图片用Scion Image 图像分析软件( Scion Corporation) 处理，测量细胞直径与面积，用以下公式计算细胞容积( V) : V = 4/3 × ( 直径/2)3,并标准化细胞容积( Vst) : Vst= ( Vt/ Vo) × 100% ( Vt: 细胞的实际容积，Vo: 药物刺激前即等渗条件下( 对照) 的细胞平均容积) .实验分为空白对照组( Iso) 、阿霉素组( ADM,2. 5 μmol·L- 1) 、氯通道阻断剂 NPPB 组( 100 μmol·L- 1) 、阿霉素( 2. 5 μmol·L- 1) + NPPB( 100μmol· L- 1) 组。实验环境温度为室温 ( 20℃ ~24℃ ) .

　　1. 4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞种植于 6 孔板中，培养箱中培养 12 h,按上述实验分组进行处理。36 h 后，收集细胞，用 PBS 冲洗，并用预冷的70% 乙醇于 - 20℃ 固定 30  清洗并离心，加入 propidium iodide( PI,50 mg·L- 1) ,室温避光染色15 min.用流式细胞仪( Coulter EPTCSXL-31240,Coulter,USA) 进行分析。

　　1. 5 膜片钳全细胞记录技术 EPC-7 膜片钳放大器( List Electronic,Germany) 用于记录全细胞电流，CED1401 ( Cambridge,UK) 用于数字化( 采样频率 3kHz) 电流和电压信号。拉制的电极是硼硅酸盐毛细玻璃管，其内径为 0. 86 mm,外直径为 1. 5 mm,内含细长丝，于垂直微电极拉制器( PB-7) 上，分两步拉制。将电极内液充灌至电极容积的 1/3 至 2/3间，此时阻抗约为( 5 -10) MΩ。全细胞记录模式构建完成后，开始记录实验数据。将细胞钳制在氯离子的平衡电位( 0 mV) .按指令电压的顺序( ±40,0和 ± 80 mV) 循环记录氯电流变化。每一电位持续时间约200 ms,两电位之间间隔4 s.形成全细胞记录后，补偿电容。灌流等渗液 3 min 后，加入阿霉素，连续观察氯电流变化，待阿霉素激活氯电流达峰值，并平衡 5 min 后，灌流含氯通道阻断剂与阿霉素的等渗液，观察氯电流变化，直至电流抑制到最小值，并平稳 3 min 以上。实验数据用 EPC ( CED,Cambridge,UK) 软件分析。实验 环境 温 度 为 室 温( 20℃ ~24℃) .

　　全细胞膜片钳记录所需电极内液组成( mmol·L- 1) : 1 EGTA[乙二醇-双-( 2-氨基乙醚) 四乙酸],1. 2 MgCl2, 70 N-methyl-D-glucamine chloride( NMDG-Cl) ,10 HEPES,140 D-mannitol 和2 ATP,并用 Tris-base 调节 pH 至 7. 25.

　　1. 6 统计学处理 采用 SPSS 12. 0 软件对实验数据进行统计与分析，数据用珋x ± s 表示，采用方差分析( ANOVA) 检验差异的显着性。

　　2 结果

　　2. 1 氯通道阻断剂抑制阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡 用流式细胞仪检测阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡率。实验结果显示，不加任何药物处理的空白对照组细胞，其凋亡率为( 1. 74 ± 2. 34) % ( n = 3)( Fig 1A) ,而用 2. 5 μmol·L- 1的阿霉素处理 36 h的细胞，凋亡率增加至( 23. 56 ±3. 45) % ( n =3,P <0. 01,vs control) ( Fig 1C) .

　　为了探讨氯通道在阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡中的作用，我们观察了氯通道阻断剂 NPPB 对阿霉素诱导的凋亡的影响。结果显示，单纯用 NPPB( 100 μmol·L- 1) 处理的细胞，凋亡率为( 1. 58 ±1. 35) % ,与空白对照组相比，差异没有显着性( n =3,P > 0. 05,vs control) ( Fig 1B) .NPPB( 100 μmol·L- 1) 与阿霉素( 2. 5 μmol·L- 1) 共同处理细胞，CNE-2Z 细胞凋亡率为( 13. 29 ± 2. 78) % ,与阿霉素组凋亡率( 23. 56 ± 3. 45) % 相比，差异有显着性( n =3,P <0. 01) ( Fig 1D) .

　　2. 2 氯通道阻断剂抑制阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡性容积减小 细胞图像分析结果显示，等渗液灌流细胞 2 h,细胞容积及形态基本保持不变( Fig2A) .而用含 2. 5 μmol·L- 1阿霉素的等渗液灌流细胞 10 min 内，便可观察到 CNE-2Z 细胞的凋亡性容积减小的发生，在连续观察 120 min 的过程中，发现细胞体积逐渐减小，皱缩( Fig 2B) .而阿霉素和NPPB 联合作用 120 min 时的细胞体积并没有减小( Fig 2C) .Fig 2D 显示了药物作用前后 120 min 细胞容积变化百分率，阿霉素灌流 120 min 时细胞体积减小至( 90. 36 ±0. 42) %( n =21,P <0. 01) ,阿霉素和 NPPB 联合作用组细胞体积为 ( 102. 83 ±0. 44) % ( n = 27) ,与阿霉素组相比，差异有显着性( P <0. 01) .单纯用 NPPB 灌流细胞，细胞体积有所增大，120 min 时为( 104. 05 ± 0. 65) % ( n = 14) .

　　实验结果表明，氯通道阻断剂 NPPB 可以明显抑制阿霉素诱导的鼻咽癌细胞容积减小，提示阿霉素可能通过激活氯通道而诱导鼻咽癌细胞凋亡，早期发生的凋亡性容积减小。2. 3 阿霉素激活的 CNE-2Z 细胞氯电流 为了进一步验证阿霉素是否通过激活细胞氯通道而诱导细胞凋亡性容积减小，我们用全细胞膜片钳技术记录了阿霉素激活的 CNE-2Z 细胞氯电流。Fig 3A 所示为阿霉素诱导的鼻咽癌细胞氯电流全程图。在等渗条件下，可记录到一个微弱且稳定的背景氯电流( Fig 3A、B) .胞外灌流阿霉素，可以明显激活氯电流，该电流具有外向优势，外向电流明显大于内向电流，且未见明显时间依赖性失活( Fig 3A、C) .该电流的翻转电位为( -3. 00 ±0. 84) mV ( n =8) ,接近氯离子平衡电位。当钳制电压为 ± 80 mV 时，该电流的平均峰值高达( - 31. 67 ± 2. 38) pA/pF( - 80mV) 、( 49. 41 ± 3. 23) pA / pF( + 80 mV) ( n = 6,P <0. 01,vs Iso) ( Fig 3E) .在阿霉素激活氯电流且达平稳的基础上，加入氯通道阻断剂 NPPB( 100 μmol·L- 1) ,氯电流迅速降低( Fig 3A、D) .其对外向电流的抑制率为( 79. 96 ±6. 57) %( +80 mV) ,对内向电流抑制率为( 76. 64 ±4. 66) % ( -80 mV) ( n =5,P < 0. 01,vs ADM) ( Fig 3E) ,对内外向电流间的抑制作用差异无统计学意义。以上实验结果提示，氯通道在阿霉素诱导 CNE-2Z 细胞凋亡早期的过程中起重要作用。

　　在所有实验中，用来配制 NPPB 的 DMSO 在灌流液中的终浓度低于1%( V/V) ,其对阿霉素诱导的细胞容积减小及激活的氯电流没有影响，且 24 h 内无细胞毒性。

　　3 讨论

　　细胞凋亡异常在肿瘤以及许多疾病的发生发展中起着重要的作用。细胞凋亡发生于生理以及病理状态下对不同刺激的应答过程中，具有一系列生化和形态学特征，其伴随着细胞进行性的体积缩小，以及线粒体细胞色素 C 释放、caspase 激活、核固缩、DNA 片段化和凋亡小体的形成[9]等。其中早期细胞皱缩或凋亡性容积减小( AVD) 是在等渗状态下发生的细胞体积缩小，具有普遍的意义。研究表明[10],AVD 发生于细胞色素 C 释放、caspase 活化以及 DNA 断裂之前，是细胞凋亡早期的标志性事件。

　　鉴于 AVD 在细胞凋亡早期触发机制中的关键性作用，深入探讨 AVD 的发生、发展过程及其机制，对于揭示凋亡规律有重要意义。

　　AVD 的发生被认为与细胞内 K+与 Cl-浓度减小有关[11].在凋亡早期，凋亡诱导剂激活钾通道与氯通道，促使 K+与 Cl-外流，并驱动水的外流，致使细胞体积减小发生 AVD,进而诱发凋亡[6,12].氯通道参与细胞的多种生理功能，如细胞增殖[13]、迁移[14]、凋亡[6]、细胞溶血[15],还可参与冰片引起的细胞体积减小过程[16].我们前文报道，中药丹参酮发挥抗肿瘤作用的机制可能是通过激活氯通道引起氯离子和水外流，诱导 AVD 发生，进而引起细胞凋亡[8].阿霉素作为一种常用的抗肿瘤药物，它是否也可能通过激活氯通道诱导 AVD 和细胞凋亡? 目前国内外没有相关报道。本实验采用活细胞影像系统实时拍摄细胞图像，分析细胞凋亡早期的细胞容积变化。实验结果表明，在阿霉素作用的 10 min内，便可观察到 CNE-2Z 细胞凋亡性容积减小的发生; 而在阿霉素继续作用的 2 h 内，细胞容积持续减小。流式细胞术检测到阿霉素诱导 CNE-2Z 细胞凋亡，氯通道阻断剂 NPPB 可以完全阻抑 CNE-2Z 细胞凋亡性容积减小、明显阻抑细胞凋亡，提示阿霉素可以激活 CNE-2Z 细胞氯通道，进而诱导细胞发生AVD 和细胞凋亡。

　　为了进一步验证这个观点，我们用膜片钳法记录 CNE-2Z 细胞阿霉素激活的全细胞电流，直接观察阿霉素对氯通道的激活作用。结果显示，细胞外灌流阿霉素可激活一个外向电流，该电流与氯离子跨细胞流动所产生的电流一致，其翻转电位接近氯离子的平衡电位 -0. 9 mV( 根据本实验所用细胞外灌流液及电极内液配方计算而得) ,该电流可被氯通道阻断剂 NPPB 抑制，由此推知该电流为氯通道所介导的氯电流。本实验结果为阿霉素激活氯通道提供了直接的实验证据。由于实验用细胞内外液主要离子为 Na+、Cl-、Ca2 +,而在本实验条件下计算出的 Na+、Ca2 +平衡电位均高于 200 mV,因此该电流与上述两种阳离子电流无关。

　　本实验观察了阿霉素对氯通道的作用，以及阻断氯通道对阿霉素诱导凋亡和凋亡性容积减小作用的影响。结果表明，阿霉素可激活鼻咽癌细胞氯通道，氯通道阻断剂 NPPB 可以明显抑制阿霉素诱导的氯电流、拮抗阿霉素引起的细胞凋亡性容积减小和细胞凋亡，提示阿霉素可能通过激活氯通道诱导细胞凋亡，氯通道在阿霉素抗肿瘤机制中发挥重要作用。本实验的完成，加深了我们对阿霉素抗癌机制的认识。