融合基因GMCSFBZLF1重组腺病毒表达载体的构建

融合基因gmcsfbzlf1重组腺病毒表达载体的构建

【关键词】 疱疹病毒4型，人;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因，即早;基因融合;遗传载体

【摘要】 目的 构建粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)和eb病毒即刻早期基因(bzlf1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 采用逆转录聚合酶链反应分别获得gmcsf和bzlf1编码序列的cdna，应用剪接式重叠延伸(soe)技术将两段基因通过多肽接头(gly4ser)3 的dna 序列进行连接，构建融合基因gmcsfbzlf1。将融合基因gmcsfbzlf1定向亚克隆至padtrackcmv质粒，在原核细胞e. coli bj5183中完成穿梭质粒与骨架质粒padeasy1的同源重组，构建融合基因gmcsfbzlf1真核表达载体padgmcsfbzlf1。将真核表达载体padgmcsfbzlf1转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vadgmcsfbzlf1。rtpcr鉴定感染重组腺病毒的293细胞中gmcsfbzlf1基因的表达。结果 gmcsfbzlf1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置，且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vadgmcsfbzlf1的293细胞中检测到融合基因gmcsfbzlf1的转录表达。结论 成功地构建了融合基因gmcsfbzlf1重组腺病毒表达载体，为进一步探讨gmcsfbzlf1的功能提供了理论基础和实验依据。

【关键词】 疱疹病毒4型，人;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因，即早;基因融合;遗传载体

　construction of recombinant adenovirus expression vector encoding gmcsfbzlf1 fusion gene cui ying, wang yun, liu chengyu, et al (qingdao university medical college, qingdao 266021, china); [abstract] objective to construct human granulocytemacrophage colonystimulating factor (gmcsf) gene and ebv encoding immediate early genes (bzlf1) fused to gmcsfbzlf1 gene and the fusion gene recombinant adenovirus expression vector. methods gmcsf cdna and bzlf1 cdna were acquired by rtpcr. the fusion gene gmcsfbzlf1 was constructed through a polypeptide linker (gly4ser) 3 by using spliced overlap extension (soe). the fusion gene gmcsfbzlf1 was subcloned into padtrackcmv plasmid. the shuttle plasmid and the backbone plasmid padeasy1 were recombinated homologously in bj5183 cells, then fusion gene eukaryotic expression vector padgmcsfbzlf1 were constructed. padgmcsfbzlf1 vector was transfected into 293 cells to obtain recombinant adenovirus vadgmcsfbzlf1. rtpcr was used to identify the expression of fusion gene gmcsfbzlf1 in 293 cells infected with vadgmcsfbzlf1. results the result of dna sequencing demonstrated that gmcsfbzlf1 gene inserted in the expected site in the recombinant adenovirus expression vector and the insertion sequence was wholly correct. the expression of fusion gene gmcsfbzlf1 could be detected in the 293 cells infected with vadgmcsfbzlf1. conclusion the fusion gene gmcsfbzlf1 recombinant adenovirus expression vector has been constructed successfully, which might furnish the rationale and experimental evidence for further study on the function of gmcsfbzlf1 gene.

　　[key words] herpesvirus 4, human; granulocytemacrophage colonystimulating factor; genes, immediateearly; gene fusion; genetic vectors

　　eb病毒(ebv)是嗜b淋巴细胞的疱疹病毒，为致瘤病毒之一。文献报道，该病毒与多种人类恶性肿瘤如burkitt淋巴瘤、鼻咽癌(npc)、霍奇金病、免疫缺陷病人的b淋巴细胞瘤及胃癌等发生有关[14]。hoshikawa等[1]研究表明， ebv基因组存在于几乎所有ebv阳性癌组织的癌细胞中，提示ebv可能是治疗ebv阳性肿瘤的理想靶点。ebv即刻早期基因(bzlf1)是诱导潜伏期病毒活化进入裂解期的关键基因，其编码蛋白为转录激活因子，可激活病毒早期基因和晚期基因使病毒进入裂解期进行复制。ebv大量增殖后经细胞膜释放可导致肿瘤细胞溶解死亡，起到选择性杀伤ebv阳性肿瘤细胞的作用[5]。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)主要由t细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，将gmcsf基因转入肿瘤细胞内，可以提高其免疫原性从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答[6]。本研究拟将gmcsf编码基因和bzlf1进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，深入探讨融合基因表达对ebv阳性肿瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗ebv相关肿瘤提供实验基础和理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂、质粒和细胞系

　　限制性核酸内切酶ecorⅴ和bglⅱ，t4 dna连接酶，dl 10 000 dna marker，dl 2 000 dna marker，taq dna聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司;dna转染试剂盒lipofectamine 2000 购自invitrogen公司;质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。dmem培养液、trizol、胎牛血清购自美国gibco公司。反转录酶为promega公司产品。qiaexⅱ纯化试剂盒购自qiagen公司。携带gfp报告基因的腺病毒穿梭质粒padtrackcmv，e1 区和e3 区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒padeasy1，大肠杆菌bj5183和dh10b以及人胚肾293细胞，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。ebv阳性b958细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。

　　1.2 引物设计

　　根据gmcsf和bzlf1开放读码框序列，以dnastar软件设计扩增人gmcsf和ebv bzlf1 基因的特异性引物，并在gmcsf上游引物的5′ 端引入bglⅱ酶切位点和保护性碱基ga，下游引物3′ 端删除终止密码tga，引入linker;bzlf1下游引物5′ 端引入ecorⅴ酶切位点和保护性碱基gc，上游引物3′ 端引入linker。linker(gly4ser)3为编码15个氨基酸组成的疏水性多肽的dna 序列，序列为5′ggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagc3′。gmcsf引物(上游p1、下游p2)和bzlf1引物(上游p3、下游p4)序列见表1。上述序列中下划线部分为linker，黑体部分为酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(page纯化)，扩增产物gmcsf长为470 bp，bzlf1长为785 bp，融合基因长为1 210 bp。

　　1.3 gmscf和bzlf1基因的扩增

　　取正常人外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞。将收集的单个核细胞加入含有植物血凝素的dmem培养液中，37 ℃活化24～48 h后收集活化的单个核细胞。采用trizol一步法分别提取外周血活化的淋巴细胞总rna和ebv阳性b958细胞系总rna，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cdna用作pcr反应模板。pcr反应体系为25 μl，其中包括10×buffer 2.5 μl， mgcl21.5 mmol/l，dntp 0.2 mmol/l，上下游引物各0.3 mmol/l，taq dna聚合酶 1 u，cdna 2 μl，无菌去离子水补至25 μl。反应条件为：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。pcr扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/l)的8 g/l琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外线透射仪下观察电泳结果。切胶回收pcr产物，用qiaexⅱ纯化试剂盒进行pcr产物的纯化。表1 bzlf1和gmcsf引物设计名称序列长度gmcsfp1 p1

　　1.4 目的基因的ta克隆和测序

　　分别将gmcsf和bzlf1 pcr的纯化产物与pmd18t载体连接，转化入高效 dh10b感受态细菌中，在含有xgal和iptg的氨卞青霉素lb平板上进行蓝白斑选择。分别将tagmcsf和tabzlf1阳性克隆送北京华大基因研究中心进行dna序列测定，测序结果与genbank中gmcsf和ebv标准株bzlf1编码基因序列进行比对。

　　1.5 融合基因gmcsfbzlf1的构建

　　以tagmcsf和tabzlf1质粒为模板进行pcr扩增反应，分别获得带有linker互补序列的gmcsf和bzlf1片段。将gmcsf和bzlf1的pcr产物行琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，以其为模板采用重叠延伸pcr法[7]获得融合基因片段gmcsfbzlf1。重叠延伸pcr反应体系容积为50 μl, 包括10×buffer 5 μl， mgcl2 3 mmol/l，dntp 0.4 mmol/l，上下游引物p1、p4分别为0.5 mmol/l，高保真taq dna聚合酶2.5 u，模板2 μl，无菌去离子水补至50 μl。反应条件为：95 ℃预变性2 min;然后95 ℃ 45 s、58 ℃ 45 s、72 ℃2 min，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。延伸结束以后，向pcr体系中加入datp 2 mmol/l，taq dna聚合酶 1 u，继续72 ℃延伸30 min。将纯化后的gmcsfbzlf1融合基因片段插入到pmd18t载体进行ta克隆，提取质粒dna进行酶切鉴定和dna序列分析。

　　1.6 重组腺病毒padgmcsfbzlf1的构建

　　质粒tagmcsfbzlf1和腺病毒穿梭质粒padcmv分别用ecorⅴ和bglⅱ进行双酶切，连接后转化dh10b高效感受态细菌中，培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒dna进行padtrackcmvgmcsfbzlf1重组体的pcr筛选及酶切鉴定。

　　重组padtrackcmvgmcsfbzlf1质粒用限制性核酸内切酶pmeⅰ酶切线性化，并用碱性磷酸酶将线性化质粒去磷酸化，与1 μl(0.1μg)的padeasy1质粒同时转化感受态 bj5183，将转化的bj5183 感受态菌液涂布于含35 mg/l卡那霉素的lb平板，37 ℃培养16～20 h。挑取较小菌落，在含卡那霉素(35 mg/l)的lb液体培养基中37 ℃振摇培养12～16 h，碱裂解法小量提取质粒dna，用限制性内切酶pacⅰ酶切后电泳进行鉴定，阳性质粒命名为padgmcsfbzlf1。构建好的重组腺病毒载体经过测序鉴定，证明插入的序列正确无误。

　　1.7 重组腺病毒的制备

　　在25 cm2培养瓶中常规培养293细胞，当细胞生长至50%～70%融合时弃去培养基，按照脂质体转染试剂盒(lipofectamine 2000)使用说明书，将带有gmcsfbzlf1融合基因的重组腺病毒载体转染293细胞。在观察到细胞荧光出现5～7 d后收获细胞，反复冻融3次裂解细胞，离心除去细胞碎片，取上清再次接种293细胞，如此重复3～4 次。

　　1.8 rtpcr检测gmcsfbzlf1 mrna

　　用重组腺病毒vadgmcsfbzlf1感染293细胞，3 d后收集细胞，1 000 r/min 离心10 min，弃上清。采用trizol一步法提取细胞总rna，所获rna加dnaseⅰ消化处理可能污染的dna后进行rtpcr检测。作为对照，提取未感染重组腺病毒的293细胞rna进行rtpcr，pcr产物于琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 目的基因的rtpcr扩增

　　结果显示，人外周血淋巴细胞gmcsf和ebv阳性b958细胞bzlf1编码序列cdna的pcr产物长度分别为470 bp和785 bp(图1)。序列分析示，gmcsf和bzlf1编码序列cdna与genbank中标准株相应序列一致。

　　2.2 融合基因pcr电泳和测序结果

　　融合基因gmcsfbzlf1的pcr扩增产物长度为1 210 bp。琼脂糖凝胶电泳显示，与dna标准分子质量参照物dl 15 000比较，与预测结果一致(图2)，测序结果与gmcsf、bzlf1以及linker的核苷酸序列一致。

　　m：dl 2 000相对分子质量标准;①、②gmcsf基因pcr 产物(470 bp);③、④bzlf1 基因pcr 产物(785 bp);⑤阴性对照。

　　图1 目的基因的pcr扩增产物

　　m：dl 15000相对分子质量标准;①～⑥gmcsfbzlf1基因pcr产物;⑦阴性对照。

　　图2 融合基因gmcsfbzlf1的pcr扩增产物

　　2.3 腺病毒质粒穿梭载体padtrackcmvgmcsfbzlf1的鉴定

　　质粒tagmcsfbzlf1经bgl ⅱ和ecor ⅴ双酶切后定向亚克隆入穿梭载体padtrackcmv，构建重组质粒padtrackcmvgmcsfbzlf1，提取质粒padtrackcmvgmcsfbzlf1行限制性核酸内切酶bgl ⅱ和ecor ⅴ双酶切分析，得到长1 210 bp的融合基因片段和约9 200 bp的片段(图3)。

　　2.4 融合基因gmcsfbzlf1真核表达载体的构建和鉴定

　　padtrackcmvgmcsfbzlf1与padeasy1质粒共转化感受态e. coli bj5183发生同源重组获得padgmcsfbzlf1重组体，对padgmcsfbzlf1重组体测序分析表明，padgmcsfbzlf1真核表达载体构建成功，融合基因gmcsfbzlf1片段插入正确。重组腺病毒载体携带2个独立的cmv启动子表达盒，分别表达融合基因gmcsfbzlf1和gfp;转染48 h后即在荧光显微镜下观察到293细胞中gfp荧光，可间接反映融合基因的表达。随传代次数增加，重组腺病毒感染性稳定且增强，致细胞病变作用的时间缩短，通常传至4～5代时，在接种病毒后24～48 h，可观察到几乎所有细胞均出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vadgmcsfbzlf1。提取重组腺病毒感染293细胞总rna经rtpcr扩增，琼脂糖凝胶电泳显示特异性1 210 bp预计大小的片段(图4)，表明重组腺病毒在293细胞能有效转录。

　　3 讨 论

　　ebv相关肿瘤组织中ebv只存在于癌细胞而正常细胞阴性，使靶向基因治疗ebv相关肿瘤有可能通过ebv而实现。由于在ebv阳性的肿瘤细胞中，病毒通常以潜伏形式存在，并不影响宿主细胞的正常代谢，因此诱导其进入裂解期，进而特异性杀伤ebv阳性肿瘤细胞，有望成为治疗ebv相关肿瘤新的手段。

　　近年来许多研究结果表明，bzlf1表达可诱导病毒潜伏期活化进入裂解期，bzlf1编码蛋白为转录激活因子，可诱导潜伏状态的ebv进入裂解期复制[8]。孙淑红等[5]研究显示，携带外源性bzlf1基因的重组腺病毒能有效感染ebv阳性上皮细胞，进而诱导细胞潜伏期ebv进入裂解期进行复制，ebv增殖后经细胞膜释放最终可以特异性地杀伤ebv阳性肿瘤细胞。

　　细胞因子基因免疫是目前肿瘤基因治疗研究的热点，将具有抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使体内持续存在一定水平的内源性细胞因子以发挥抗肿瘤的作用。gmcsf是一种重要的免疫调节分子，它不仅可诱导在t细胞免疫反应中起关键作用的dc细胞成熟、分化，而且在免疫治疗过程中可增强主要和次要的抗体反应，以促进dc等apc分化、成熟和活化及上调cd86的表达水平，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和adcc效应等活性;促进th、tc、nk细胞在肿瘤部位浸润，抑制肿瘤细胞的生长。gmcsf强烈激活特异免疫反应这一突出作用可用于肿瘤治疗。nakamura等[9]用腺病毒将表达于ct26细胞中的鼠内源性肿瘤抗原基因gp70和gmcsf转导入小鼠骨髓dcs, 由于gmcsf转入表达肿瘤相关抗原的dcs细胞，能够提高dcs细胞趋化因子cc亚族受体7的表达，而增强dc细胞迁移进入引流淋巴结的能力，从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答。qiu等[10]通过重组腺病毒将p53和gmcsf基因共转导入人喉癌hep2细胞，发现可以有效诱导肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤特异性tc细胞大量浸润并抑制hep2细胞的增长。

　　已经有研究证实，将细胞因子基因gmcsf转入肿瘤细胞可使肿瘤细胞的免疫原性增强而致瘤性下降，从而提高诱导机体特异性的抗肿瘤免疫反应，但是该作用不够强大，对已发生的肿瘤治疗效果较差。为此，我们综合肿瘤基因治疗和细胞因子基因治疗的作用特点，将bzlf1基因和gmcsf基因融合后构建重组腺病毒表达载体，同时发挥bzlf1基因靶向杀伤ebv阳性癌细胞和gmcsf基因增强机体的抗肿瘤免疫作用。该融合基因载体可以在基因水平上对bzlf1和gmscf基因拷贝数进行控制，精确控制两种功能性蛋白的比例，以达到最佳治疗效果，从而为探讨融合基因协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞的作用奠定实验基础。

　　本研究将gmscf和bzlf1基因进行融合，成功构建了重组腺病毒表达载体。基因融合采用经典的重叠延伸pcr法，使用柔性连接子(linker)将gmcsf和bzlf1基因相连，简化了基因融合过程。而表达载体则采用当今广泛应用的adeasy系统，该系统可在原核细胞e. coli bj5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，使得载体的构建程序快速而有效。

　　重组腺病毒表达载体经293细胞包装获得重组腺病毒vadgmcsfbzlf1，rtpcr鉴定结果表明vadgmcsfbzlf1重组腺病毒可在293细胞中有效转录。为进一步探讨该融合基因在ebv阳性肿瘤细胞的表达，同时发挥gmscf基因增强抗肿瘤免疫和bzlf1基因诱导潜伏期ebv进入裂解期复制的作用，进而协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞奠定了实验基础。

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