何首乌饮对D半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺EGF、

何首乌饮对d半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺egf、egf mrna表达的影响

【关键词】 何首乌饮;衰老大鼠;下颌下腺;egf;egf mrna

【摘要】 目的 观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺表皮生长因子(egf)及egf mrna表达的影响。方法 采用d半乳糖衰老大鼠模型，何首乌饮干预分为治疗和预防两部分，用免疫组化及原位杂交法检测下颌下腺egf、egf mrna阳性表达的改变。结果 预防性实验部分egf、egf mrna表达以正常组最高，模型组最低，各预防组中预防中剂量组最高，组间比较有高度统计学意义(p<0.01)。治疗性实验部分以正常组最高，自然恢复组最低，各治疗组中以治疗中剂量组最高，组间比较差异显著(p<0.01)。结论 何首乌饮可提高下颌下腺egf、egf mrna的表达而达到抗衰老的作用。

【关键词】 何首乌饮;衰老大鼠;下颌下腺;egf;egf mrna

　【abstract】 objective to observe the effects of heshouwuyin on the expressions of egf and egf mrna in submandibular glands of aging rats. methods dgalactose senescence model was adopted. the effects of heshouwuyi were divided into two parts: preventive and treatment experiments. sp immunohistochemistry was applied to observe the expression of egf and in site hybridization method was used to observe the expression of egf mrna. results among preventing normal and model groups, egf and egf mrna expression in normal group was the highest, that in model rats was the lowest, the effect with medium dose of heshouwuyin preventing group was better than that of the others. in preventing groups, egf and egf mrna expressions in submandibular gland cells showed significant statistic difference when compared with normal or model group (p<0.01). the effect with medium dose of heshouwuyin treating group rats was better than that of the others. there was a significant difference between normal control group and selfrestoring group (p<0.01). conclusions heshouwuyin can enhance the expressions of egf and egf mrna in submandibular glands for delaying aging.

　　【key words】 heshouwuyin; aging rat; submandibular gland; egf; egf mrna

　　下颌下腺是具有外分泌和内分泌双重功能的腺体，有关衰老下颌下腺研究很少。www.lw881.com研究表明，下颌下腺分泌量随年龄增长明显下降〔1〕。本实验检测下颌下腺表皮生长因子(egf)、egf mrna的表达状况，探讨何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺分泌egf功能的影响，进一步探讨下颌下腺的衰老相关性变化，为衰老病人涎腺功能减退性疾病的预防、治疗提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　egf、egf mrna、sp试剂盒及二氨基联苯胺(dab)显色剂(武汉博士德生物工程公司);vt1000s振荡切片机(德国leica公司);olympus光学显微镜(日本);何首乌饮由《宣明论方》何首乌丸加味而成(贾春华教授提供)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物来源及分组

　　实验大鼠购自河北省实验动物中心，合格证编号：605106。实验动物饲养室温度(22±2)℃，相对湿度50%～70%，选用体重180～220 g的8周龄清洁级sd雌性大鼠90只，随机分为预防性和治疗性两大实验部分，每部分5组，每组9只。

　　1.2.2 动物模型的建立

　　大鼠称重后按300 mg·kg-1·d-1腹腔注射d半乳糖，每日一次，连续60 d。

　　1.2.3 其他各组动物的处理方法

　　正常组(n)大鼠正常喂60 d。何首乌饮预防高(ph)、中(pm)、低(pl)剂量组大鼠腹腔注射d半乳糖的同时分别灌胃何首乌饮(3.872，1.936，0.968 g/100 g)，水煎浓缩成0.6 ml/100 g，1次/d，连续60 d。阴性对照组(nc)大鼠按0.5 ml/100 g腹腔注射生理盐水，1次/d，连续60 d后灌胃生理盐水0.6 ml/100 g，1次/d，连续60 d。自然恢复组(sr)大鼠造模成功后正常喂养60 d。何首乌饮治疗th、tm、tl剂量组大鼠造模成功后分别灌胃何首乌饮(剂量、时间同上)。

　　1.2.4 免疫组织化学切片制备及染色

　　大鼠麻醉后，开胸，经左心室插管入主动脉，4%多聚甲醛灌注，取下颌下腺，标本固定于4%多聚甲醛液中24 h，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。连续切片，片厚6 μm，每隔30张取相邻5张，按试剂说明书的操作步骤，用sp法行常规免疫组化染色、去除组织蛋白等处理，操作完成后封片。

　　1.2.5 原位杂交染色程序

　　按试剂说明书的操作步骤，石蜡切片经常规脱蜡至水，后固定，预杂交，杂交，洗涤，封闭，滴加细胞免疫组化法(sabc)试剂，滴加生物素化过氧化物酶，dab显色，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片。

　　1.2.6 细胞计数

　　对egf免疫细胞化学染色的切片及egf mrna原位杂交染色的切片，在400倍显微镜下记算导管细胞中阳性细胞数。

　　1.3 统计学分析

　　采用spss11.0统计软件进行处理，计量资料描述组间比较行单因素方差分析，组间多重比较用q检验。

　　2 结 果

　　egf阳性反应颗粒为浅棕色至深褐色，主要分布于颌下腺颗粒曲管(gct)细胞及纹状管细胞顶部胞质中，腺泡细胞为阴性。提示egf可能定位于gct细胞分泌颗粒中，且同一导管内不同细胞的反应程度不同，有的细胞内颗粒清晰，着色深，有的着色浅，还有的不着色。下颌下腺egf mrna杂交反应产物呈浅棕色或深褐色颗粒，杂交信号主要分布于纹状管和颗粒曲管上皮细胞中，其上皮细胞胞质呈阳性，腺泡未见阳性反应,与免疫组化相同，同一导管内不同细胞的反应程度亦各不相同。见图1，图2。

　　方差分析结果显示，预防性实验部分的组间egf、egf mrna表达比较，差异有统计学意义(p<0.01)。结果显示，egf、egf mrna表达以正常组最高，模型组最低，各预防组处于中间水平，其中预防中剂量组最高。治疗性实验部分的组间egf、egf mrna表达比较差异亦有统计学意义(p<0.01)。结果显示，egf、egf mrna表达以正常组最高，自然恢复组最低，各治疗组处于中间水平，其中治疗中剂量组最高。见表1。表1 实验大鼠下颌下腺egf、egf mrna 的表达　图1 各组egf表达(dab，×400)　图2 各组egf mrna的表达

　　3 讨 论

　　egf是在雄鼠下颌下腺中最先提纯的、且主要由下颌下腺产生并分泌的、对机体有重要作用的生物活性物质之一，是一条由53个氨基酸残基组成的单链，对细胞的生长和增殖有明显的调节作用。egf通过与细胞膜上的egf受体结合而广泛作用于机体各组织和器官，对多种细胞有强烈促进有丝分裂的作用;并可促进细胞角质化和抑制胃酸分泌，可能参与溃疡愈合的调节作用〔2〕。研究发现egf参与维持胃肠道黏膜的完整性,可保护胃肠道黏膜免受多种损伤因子所造成的损害〔3〕。由此可见，在机体病理发生发展过程中，下颌下腺内的生物活性物质也起有一定的作用。衰老对下颌下腺影响的研究资料较少，本实验表明，d半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺egf表达明显减少，药物干预各组均有不同程度的提高，何首乌饮预防组效果好于治疗组，其中，pm组效果最好，提示何首乌饮可提高下颌下腺egf的表达而影响机体其他器官功能。

　　同时，本文采用原位杂交方法，进一步探讨衰老对大鼠下颌下腺组织中egf mrna的影响。结果表明，egf原位杂交反应产物分布于纹状管和颗粒曲管的上皮细胞，随着下颌下腺组织的衰老改变，大鼠下颌下腺egf基因的表达也发生改变，egf mrna杂交信号明显减弱，说明衰老可从基因转录水平降低egf的合成。应用何首乌饮预防、治疗各组其egf mrna杂交信号明显增强，说明其能增加egf mrna的转录，它对egf基因表达的增强可能发生于转录水平。

　　传统医学认为脾肾亏虚夹瘀是衰老的基本病机，何首乌饮由《宣明论方》何首乌丸加味而成，通过补肾(炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿)，补脾(茯苓)，活血化瘀(丹参)使脏器虚损得到恢复，体内瘀血得以清除，以达到虚得以补，实得以泻，脏器功能得以正常发挥的目的，促进机体健康长寿。本研究结果显示何首乌饮可提高下颌下腺egf、egf mrna的表达而达到抗衰老的作用，以预防中剂量组效果最好，与葛志华等〔4～6〕何首乌饮可通过凋亡相关蛋白的调节，抑制下颌下腺细胞的凋亡，可改善衰老大鼠下颌下腺组织结构与超微结构的衰老变化的结果一致，进一步说明何首乌饮具有抗衰老的作用。

【参考文献】
　1 赵培林，李肇特.大鼠实验性胃溃疡自愈过程中下颌下腺gct细胞的组织学和组织化学观察〔j〕.中国组织化学与细胞化学杂志，1993;2(4);265.

　　2 basuroy s，sheth p，mansbach dehyde disrupts tight junctions and adherens junctions in human colonic mucosa:protection by egf and lglutamine〔j〕.am j physiol gastrointest liver physiol,2005;289(2):36775.

　　3 葛志华，赵淑敏，杨桂梅，等.何首乌饮对d半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺超微结构的影响〔j〕.中国老年学杂志， 2009;29(14)：177880.

　　4 葛志华，李俊玫，王春艳.何首乌饮对衰老模型大鼠下颌下腺组织结构的影响〔j〕.河北医药， 2009;31(19)：25324.

　　5 葛志华，高福禄，董福生.何首乌饮对d半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺bcl2、bax表达的影响〔j〕.现代口腔医学杂志，2009;23(5)：5124.

　　6 李俊玫，高福禄，葛志华，等.何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺凋亡的影响〔j〕.山东医药， 2009;49(48):345.

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