红毛毡提取物体外抗肿瘤的实验

【摘要】 目的：探讨红毛毡提取物的体外抗癌作用。方法：用mtt法检测红毛毡提取物对13种肿瘤细胞株体外生长的抑制作用。结果：红毛毡提取物对所试肿瘤细胞株的体外生长均具有较强的抑制作用，其中对急性t细胞白血病细胞jurkat、人肾癌细胞osrc2、人慢性髓质白血病细胞k562、人肺癌细胞a549和人乳腺导管癌细胞mdamb435s的作用强，半数抑制浓度(ic50)分别为9.25±3.68、10.75±2.40、10.90±3.74、11.21±3.07和12.66±1.19 μg·ml-1，其次是对人食管癌细胞eca109、人胰腺癌细胞panc1、人黑色素瘤细胞a375、人肝癌细胞qgy7703和人胃癌细胞sgc7901，半数抑制浓度(ic50)分别为14.36±2.26、15.36±6.73、15.48±1.98、17.21±10.32和19.01±5.95 μg·ml-1。结论：红毛毡提取物具有广谱抗肿瘤作用。

【关键词】 红毛毡提取物;mtt;广谱;ic50

红毛毡(ardisia mamillata),又名佛光江、老虎舌、红毛走马胎、红地毡、虎舌红，属紫金牛科植物,是一种广泛分布于中国南方地区的草本植物，具有清热利湿，活血和瘀的功效,常用于治疗痢疾，肝炎，胆囊炎，风湿，跌打劳伤，咳血，吐血，妇女痛经，血崩，小儿疳积，疮疖痈肿疼痛[1]。其叶和茎的皮层和髓部有分泌组织，内含红棕色树脂类物质、岩白菜内酯、挥发油、黄酮类、甙类、鞣质和苯醌等[2],使其具有广泛的生物学活性,为考察红毛毡提取物的体外抗肿瘤作用，我们采用mtt法检测红毛毡提取物对13种肿瘤细胞株体外生长的抑制作用，以筛选出敏感肿瘤类型，了解其作用强度，为体内试验提供参考。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂及设备

　　红毛毡提取物由本公司工艺室提供，顺铂注射液购自由云南个旧生物药业有限公司，pmi1640、dmem、l15、胰蛋白酶均为gibco产品，mtt、台盼蓝为sigma产品，dmso为成都科龙化工试剂厂产品，小牛血清购自成都哈里生物工程有限公司，胎牛血清购自hyclone公司，酶联检测仪，biorad 550型，biorad公司产品，co2培养箱，thermo 371型，美国热电公司产品，倒置显微镜，ck40f200型，日本olmpus产品。

　　1.2 细胞培养

　　sgc7901，人胃癌细胞;qgy7703，人肝癌细胞;a549，人肺癌细胞;k562，人慢性髓质白血病细胞;pc3，人前列腺癌细胞;ht29，人结肠癌细胞;osrc2，人肾癌细胞;mdamb435s，人乳腺导管癌细胞;ho8910，人卵巢癌细胞;a375，人黑色素瘤细胞;panc1，人胰腺癌细胞;jurkat，急性t细胞白血病细胞;eca109，人食管癌细胞;购于中科院上海生命科学研究院细胞库。分别培养于rpmi1640+10%小牛血清，rpmi1640+10%胎牛血清，dmem+10%胎牛血清，l15+10%胎牛血清，1% lglutamine，1×105 u·l-1 青霉素和100 mg·l-1链霉素的各培养液中,在37℃，5% co2培养箱培养。

　　1.3 体外抗癌试验

　　1.3.1 贴壁细胞

　　贴壁细胞经常规传代培养至对数生长期，弃旧培养液，加入0.25%胰酶+0.02% edta消化，待细胞变圆成单个时，加入完全培养液，轻轻吹打，使其形成单细胞悬液。收集细胞至离心管中。1000rpm·min-1离心5min。弃去上清，沉淀加入培养基悬浮混匀。台盼蓝排斥法进行细胞计数，调整细胞浓度至1×105细胞·ml-1的细胞悬液。取96孔板，每孔用移液器加入细胞悬液200μl，使每孔细胞数为2.0×104个。置37℃、5%co2培养箱中培养24h后取出96孔板，移液器小心吸去上清液，每孔分别加入用完全培养液配制的药物溶液200μl，每个浓度设三个复孔。细胞对照组加200μl的完全培养液，阳性对照加入顺铂药液200μl，每个浓度三个复孔。置37℃、5%co2培养箱中培养48h后取96孔板，直接加20μl mtt溶液，37℃、5%co2培养箱继续培养4h，吸去上清液，每孔加入二甲亚砜150μl，充分振荡5min溶解，酶标仪490nm处测定去空白od值，参比波长655nm。

　　1.3.2 悬浮细胞

　　悬浮细胞经常规传代培养至对数生长期，直接用吸管轻轻吹打，使其形成单细胞悬液。收集细胞至离心管中，1000 rpm·min-1离心5min。台盼蓝排斥法进行细胞计数，调整细胞浓度至2×105细胞·ml-1的细胞悬液。取96孔板，每孔用移液器加入细胞悬液100μl，每孔细胞数为2.0×104，每孔分别加入用完全培养液配制的药液100μl，每个浓度设三个复孔。细胞对照加100μl培养液，阳性对照加入顺铂药液100μl，每个浓度三个复孔。置37℃、5%co2培养箱中培养48h后，每孔加入5mg·ml-1 mtt溶液20μl，37℃、5%co2培养箱继续培养4h后，1000～1500 rpm·min-1离心10～15min，小心吸去上清液，每孔加入二甲亚砜150μl，充分振荡5min溶解，酶标仪490nm处测定去空白od值，参比波长655nm。

　　1.4 数据处理

　　由od值计算抑制率， 公式为：细胞生长抑制率ir=(对照组od值-实验组od值)/对照组od值×100%。半数抑制浓度ic50=细胞生长抑制率为50%的药物浓度，并ic50软件求得ic50值。

　　2 结果

　　表1 红毛毡提取物以及顺铂注射液对13株人肿瘤细胞株的体外生长抑制作用红毛毡提取物体外具有强抗肿瘤活性，对其敏感的肿瘤细胞有急性t细胞白血病细胞jurkat、人肾癌细胞osrc2、人慢性髓质白血病细胞k562、人肺癌细胞a549和人乳腺导管癌细胞mdamb435s，ic50值分别为9.25±3.68、10.75±2.40、10.90±3.74、11.21±3.07和12.66±1.19μg·ml-1，其中红毛毡提取物对mdamb435s的活性约为顺铂注射液的4倍。对所试肿瘤细胞中最不敏感的细胞是人卵巢癌细胞ho8910，但红毛毡提取物对其ic50值也低至32.42±12.47μg·ml-1。红毛毡提取物对人结肠癌细胞ht29的ic50值虽然不是最低的，其ic50值低于顺铂注射液对该细胞的ic50值，分别为25.51±0.83μg·ml-1和51.79±0.98μg·ml-1。见表1。

　　3 讨论

　　紫金牛科紫金牛属(ardisia sw)植物全世界约有300种，其主要提取物有苯酚类、皂苷类、香豆素类和苯醌类，其中苯酚类、皂苷类有较强的抗肿瘤活性，岩白菜素有良好的 抗hiv病毒作用[3-5]。虎舌红中也含有丰富的生物碱[6]，jing huang等[7]从其中提取到两种新的三帖烯皂甙，提示红毛毡有潜在的抗肿瘤活性，但国内目前无相关抗肿瘤作用的实验研究。本文的检测结果表明了红毛毡提取物体外具有强抗肿瘤活性，ic50低至10μg·ml-1，而且其抗癌谱广，对其敏感的肿瘤细胞有急性t细胞白血病细胞、人肾癌细胞、人慢性髓质白血病细胞、人肺癌细胞和人乳腺导管癌细胞等，这为临床抗肿瘤治疗提供了新的选择。不过，红毛毡提取物的体内抗肿瘤作用效果如何，其作用机制怎样都还有待进一步研究。

【参考文献】
　　1 曾云英. 野生植物赍源虎舌红的研究进展[j]. 北方园艺, 2008, (1):61-66.

　　2 卢其能. 虎舌红的生物学特性与组织培养研究[j]. 江西林业科技, 2002, 1: 5-6.

　　3 赵亚,刘合刚. 紫金牛属植物研究近况[j]. 中草药, 1999, 30(3): 228-231.

　　4 horgen fd, guinaudeau h, pezzuto jm,et al. isolation and structure elucidation of ardisenone: a new, cytotoxic alkenylphenol from ardisia iwahigensis[j]. j nat prod, 1997, 60(5): 533-5.

　　5 piacente s, pizza c, de tommasi n, et al. constituents of ardisia japonica and their in vitro antihiv activity[j]. j nat prod, 1996, 59(6): 565-9.

　　6 凌育赵,杨妙贤. 酸性染料比色法测定虎舌红中总生物碱的含量[j]. 时珍国医国药, 2007, 18(7): 1597-1598.

　　7 jing huang, hao zhang, noriko shimizu,et al. ardisimamillosides g and h, two new triterpenoid saponins from ardisia mamillata[j].chem pharm bull, 2003, 51(7): 87-877.