CD28单克隆抗体对病毒性心肌炎小鼠的治疗

【摘要】 　　目的 探讨cd28单克隆抗体（cd28 mab）对柯萨奇病毒b3（cvb3）病毒性心肌炎（vmc）小鼠的死亡率、心肌病理改变及病毒滴度的影响。方法 随机将106只balb/c小鼠分为cd28 mab组16只、病毒组40只、igg组40只及正常对照组10只，腹腔注射半数组织感染量(tcid50 )为10-6/ml的柯萨奇b3病毒0.15ml，正常对照组接种0.15ml的eagle氏液。cd28 mab组、igg组接种病毒后6、72h分别接种cd28 mab(0.1mg/kg)和igg(0.1mg/kg)。于接种病毒后第7天处死所有小鼠，取心脏，在光镜下观察心肌病理变化，采用实时荧光定量pcr（rqpcr）检测心肌组织中cvb3mrna的表达。结果 cd28单克隆抗体组小鼠死亡率、心肌病理积分、心肌cvb3mrna均低于病毒对照组(p均＜0.05)。结论 cd28单克隆抗体可降低心肌病毒滴度，减轻vmc小鼠心肌炎症，降低vmc小鼠死亡率。

【关键词】 病毒性心肌炎 柯萨奇病毒感染 小鼠 近交balb c cd28单克隆抗体

　　zhang yi, han bo, zhao lijian, liu zhenhu, xi junfang, lu kang, han xiuzhen

　　(department of pediatric cardiology, provincial hospital affiliated to shandong university, jinan 250021, china)

　　to investigate the effect of the cd28 monoclonal antibody (cd28 mab) on mortality, viral titers of myocardium and pathologic changes of myocardium in cvb3 myocarditis in mice. methods a total of 106 balb/c male mice were used in the experiments, which were randomly divided into the cd28 mab group (16 mice), the cvb3 group (40 mice), the igg group (40 mice) and the control group (10 mice). mice in the former three groups were intraperitoneally inoculated with 0.15ml cvb3 (tcid50 10-6/ml) and in the control group with 0.15ml eagle, and then mice in the igg and the cd28 mab groups were inoculated with igg(0.1mg/kg) and cd28 mab(0.1mg/kg) at 6 hours and 72 hours postinoculation(p.i.). the surplus mice in each group were sacrificed on day 7. the heart was taken and pathologic changes of cardiac muscle cells were observed under light microscopy, and expression of cvb3 mrna of myocardium was determined by the realtime quantitative polymerase chain reaction(rqpcr) method. results the mice mortality rate in the cd28 mab group was lower than that in the cvb3 group (80% vs 50%, p＜0.05); the pathological score（8.88±2.95 vs 5.25±1.91, p＜0.05) and the cvb3mrna expression level（3.48±2.89 vs 0.51±1.80, p＜0.05). conclusion cd28 mab could decrease the expression of cvb3 mrna, relieve myocardium inflammation and reduce the mortality rate.

　　key words： viral myocarditis; coxsaokie virus infection; mice, inbred balb c; cd28 monoclonal antibody

　　病毒性心肌炎（viral myocarditis, vmc）是儿科心血管系统常见疾病，该病可发生于任何年龄。在急性病毒感染后约有5%的人群发病，多数情况下为轻中型临床表现，但也可呈急性暴发型，导致猝死；部分呈慢性持续病毒感染，遗留顽固性心律失常、慢性心功能不全，发展为心肌病，严重危害患儿身心健康［1］。t细胞介导的细胞免疫是vmc致心肌损伤的重要因素之一。t细胞激活需要抗原递呈细胞(apc)双重信号刺激, 第1信号来自t细胞抗原识别受体(tcr)与主要组织相容性复合体(mhc)抗原肽复合物的特异性结合,此过程为抗原识别。第2信号又称共刺激信号, cd28/b7是最具代表性的共刺激信号通路。cd28单克隆抗体（cd28 monoclonal antibody，cd28 mab）与t细胞膜上cd28相结合，阻断t细胞活化的cd28/b7共刺激信号，从而诱导t细胞的免疫无反应性［2］。

　　本研究通过柯萨奇病毒b3（coxsackie virus b3，cvb3)腹腔注射建立vmc小鼠模型，以cd28mab进行治疗研究，观察cd28mab对vmc小鼠心肌cvb3病毒滴度、心肌病理变化以及死亡率的影响，探讨cd28mab对vmc的治疗作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 cvb3病毒液的制备 cvb3 nancy病毒株由山东大学医学院微生物教研室周亚滨副教授惠赠，在hela细胞上传代冻融3次，测得半数细胞感染率(tcid50)为10-6/ml，冻存于-80℃备用。

　　1.2 cvb3心肌炎动物模型的制备 健康雄性balb/c小鼠，二级实验动物，4～6周龄，体质量12～16g，共106只，购自山东大学实验动物中心。在山东大学附属省立医院动物实验中心层流架内饲养。随机将106只balb/c小鼠分为cd28mab组16只、病毒组40只、免疫球蛋白g（igg）组40只及正常对照组10只。cd28mab组、病毒组及igg组小鼠均腹腔接种tcid50为10-6/ml的cvb3 病毒液0.15ml，正常对照组小鼠腹腔接种等量不含病毒的eagle氏液。cd28mab组和igg组小鼠均于病毒接种后6、72h分别腹腔注射cd28mab 0.1mg/kg（购自美国bd公司）和非特异性小鼠igg 0.1mg/kg(购自美国southernbiotech公司)。观察vmc小鼠的患病情况，并于感染后第7天将小鼠全部处死，无菌条件下取心脏，与室间隔垂直方向切开，一半用10％中性甲醛固定，待做he染色；另一半冻存于-80℃冰箱，待做实时荧光定量pcr（rqpcr）。

　　1.3 病理学检查和半定量分析 病理标本在10%中性甲醛固定24h后，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm，制成组织切片。常规he染色，光镜下观察心肌病理变化。参考rezkalla等方法计算心肌病理组织学积分，即每张切片随机取5个高倍镜视野，计算每个高倍镜视野中炎细胞浸润及坏死区域面积与整个视野面积之比，无病变计0分，病变面积＜25％计1分，～50％计2分，～75计3分，＞75％计4分。

　　1.4 实时荧光定量pcr（rqpcr）检测心肌组织中cvb3mrna表达 采用trizol (购自tiangen有限公司) 提取总rna,按逆转录试剂盒(购自takara有限公司)说明合成cdna,定量pcr检测在abi prism 7500(美国应用生物系统公司) 荧光pcr仪上进行,采用sybr green ⅰ染料(toyobo公司)方法进行定量研究。引物序列:cvb3:5′aac tca ggt gcc aag cgg tat gctg3′,5′ttg gtg tgt tag gat ctg tgc3′,180bp;βactin:5′ccagccttccttcttgggtat3′,:5agaggtctttacggatgtcaac

　　g3′,95bp。反应条件为:95℃ 120s,95℃ 15s和60℃ 60s,45个循环,60℃延伸时采集荧光信号。cvb3及βactin mrna检测结果根据标准曲线由计算机软件自动给出,ct值用2-δδct表示。

　　1.5 统计学处理 采用spss13.0统计软件包。计量资料采用±s表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析(anova)，率的比较采用χ2检验。p＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 vmc小鼠的一般表现及患病情况 小鼠于接种病毒后第3天开始陆续出现异常表现，表现为耸毛、懒动、拱背、进食减少或精神不振、相互撕咬等，体质量明显下降（表1），于第3天出现死亡，第4～5天达高峰，6天后开始无死亡并且发病症状减轻。cd28mab组小鼠死亡率较病毒组及igg组明显降低（p＜0.05）。注射病毒后第7天死亡只数存活只数死亡率（％）正常对照组16.20±3.1919.20±3.0310病毒组16.00±1.6815.43±2.443280igg组15.69±3.0015.13±1.8131cd28mab组15.81±2.6413.33±1.94

　　2.2 心肌组织病理学观察结果 正常对照组小鼠心肌细胞形态正常，细胞横纹清晰，胞浆嗜酸性染色，胞核完整，肌原纤维排列整齐，间质细胞正常（图1a）。接种cvb3的小鼠心肌组织均出现不同程度的病理改变，发病率为100％。接种病毒第7天，病毒组及igg组可见心肌组织变性、坏死和部分心肌纤维断裂，大量炎细胞浸润，呈现典型的病毒性心肌炎改变（图1b、图1c）。cd28mab组心肌组织变性、坏死和炎细胞浸润均明显减轻（图1d）。cd28mab组心肌病理积分明显低于病毒组（p＜0.05），见表2。图1 各组小鼠心肌病理改变（he染色，×400）

　　3 讨 论

　　目前认为，vmc发病机制包括病毒对心肌组织的直接损害和随后继发产生的自体免疫过程［3］。t细胞参与病毒感染后宿主的免疫反应，可以抑制病毒的复制，同样可通过细胞毒效应和释放活化的细胞因子损伤自体组织。因此，t细胞介导的细胞免疫是vmc致心肌损伤的重要因素之一［1］。

　　柯萨奇b组病毒（cvb）是引起vmc的主要病原之一，约25%的vmc患者是由cvb感染所致。cvb分为6个血清型，其中cvb3有较强的噬心肌性。采用cvb3敏感动物balb/c小鼠，腹腔内注射病毒，是制备cvb3病毒性心肌炎模型的经典方法。本研究从小鼠心肌病理结果可见，接种cvb3小鼠的心肌组织均出现不同程度的病理改变，发病率为100％。心肌组织变性、坏死和部分心肌纤维断裂，大量炎细胞浸润，呈现典型的病毒性心肌炎改变，说明模型建立成功。

　　seko等［45］在急性心肌炎患者心肌组织中，用免疫组化的方法检测b71, b72和 cd40，发现其高表达，提示b7、cd40共刺激分子对心肌损伤有重要的作用。本实验应用cd28mab治疗vmc，结果表明，cd28mab可降低vmc小鼠心肌病理积分，减轻心肌损伤。其机制可能为：cd28/b7是最具代表性的共刺激信号通路，是t细胞活化、增殖及凋亡主要的共刺激信号［6］。cd28表达于90%的cd4＋t细胞和50%的cd8+t细胞表面，为组成性表达，cd28与b7分子结合后才能产生共刺激效应。cd28mab可与t细胞表面cd28分子特异性结合，使cd28共刺激分子表达降低，干预cd28与b7的结合，阻断t细胞活化的共刺激信号，防止应答过强，达到维持免疫平衡的功效。

　　有学者［78］采用腺病毒载体介导的ctla4ig治疗自身免疫性心肌炎（eam），结果表明，ctla4ig可减轻自身免疫性心肌损伤，改善心脏功能。seko［910］在cvb3诱导的急性和慢性vmc小鼠中，用b71单克隆抗体、cd40l单克隆抗体在病毒感染后按5mg/kg腹腔注射治疗，结果表明，b71单克隆抗体、cd40l单克隆抗体可以明显减轻心肌炎症。本研究结果显示，cd28mab可使vmc小鼠cvb3mrna复制减少，死亡率降低，具有一定的治疗作用。其机制可能为：①　cd28mab竞争性结合cd28，阻断cd28/b7共刺激途径，则t细胞出现反应无能(anergy) 或克隆丢失(clone deletion)［2］。这种t细胞在再次接受相同抗原刺激时，即使存在第2信号，也不能被再次激活，故t细胞活化减少,诱导t细胞的免疫无反应性［2］；②　cd28能调节fas/fasl介导的活化t细胞的凋亡。t细胞接受双信号刺激后,fas和bclxl的表达均迅速上调,且bclxl与bal形成二聚体,阻断fas/fasl介导的凋亡，cd28mab阻断t细胞活化的共刺激途径，t细胞凋亡增加，从而减轻病毒性心肌中t细胞介导的细胞免疫反应，减轻心肌炎症［11］。

　　本研究结果表明，cd28mab组vmc小鼠病毒滴度、心肌病理、小鼠死亡率均较病毒组降低，提示竞争性结合cd28，阻断cd28与b7的结合共刺激通路，可以起到一定的治疗作用，为vmc临床治疗提供了理论依据。

【参考文献】
［1］ liu p, martino t, opavsky m a, et al. viral myocarditis: balance between viral infection and immune response［j］. can j cardiol, 1996, 12(10):935943.

［2］ 姜庆,吴军,易绍萱,等.ctla4ig诱导免疫耐受的体外研究［j］.第三军医大学学报,2003,25(21):18961898.

［3］ batra a s, lewis a b. acute myocarditis［j］. curr opin pediatr, 2001, 13(3):234239.

［4］ seko y, takahashi n, ishiyama s. expression of costimulatory molecules b71, b72, and cd40 in the heart of patients with acute myocarditis and dilated cardiomyopathy［j］. circulation, 1998, 97(7):637639.

［5］ seko y, takahashi n, oshima h, et al. expression of tumour necrosis factor(tnf) receptor/ligand superfamily costimulatory molecules cd40, cd30l, cd27l and ox40l in murine heart with chronic ongoing myocarditis caused by coxsackie virus b3［j］. j pathol, 1999, 188(3):423430.

［6］ sharpe a h， freeman g j． the b7cd28 superfamily［j］． nat rev immunol, 2002, 2(2):116126．

［7］ matsui y, inobe m, okamoto h, et al. blockade of t cell costimulatory signals using adenovirus vectors prevents both the induction and the progression of experimental autoimmune myocarditis［j］. j mol cell cardiol, 2002, 34(3):279295.

［8］ 刘巍,高成,周保国,等.腺病毒载体介导的共刺激分子融合蛋白对实验性自身免疫性心肌炎的作用［j］.中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(5):452457.

［9］ seko y, takahashi n, azuma m, et al. effects of in vivo administration of antib71/b72 monoclonal antibodies on murine acute myocarditis caused by coxsackievirus b3［j］. circ res, 1998, 82(5):613618.

［10］ seko y, takahashi n, azuma m, et al. expression of a costimulatory molecule cd40 in murine heart with acute myocarditis and reduction of inflammation by treatment with anticd40l/b71 monoclonal antibodies［j］. circ res, 1998, 83(4):463469.

［11］ ishikawa f, nakano h, seo a, et al. irradiation upregulates cd80 expression through induction of tumour necrosis factoralpha and cd40 ligand expression on b lymphoma cells［j］. immunology, 2002, 106(3):354362.