电驱动与阳离子交换膜在脱氧核糖核酸捕获浓缩

摘要】 基于电驱动特性与离子交换膜的选择透过性，构建了新型、无损伤的脱氧核糖核酸（dna）捕获浓缩装置。以λ-dna为模型化合物，探究其在自组装装置中的富集特性，优化了实验条件，对浓缩液进行凝胶电泳实验以考察dna是否变性，并进行聚合酶链反应，以证明本方法回收的dna可供进一步的生物分析。结果表明：本装置在低电压条件下能够无损伤地捕获dna，浓缩液可用于进一步的生物分析，dna的富集倍数达62倍，回收率达46%。本方法操作简便，避免使用大量有机试剂，微型化可与生物芯片联用，在dna萃取、纯化与浓缩领域有较大的应用空间。

【关键词】 脱氧核糖核酸捕获；电驱动；离子交换膜；浓缩

application of electrical driven and cationic exchange membrane　to capture and enrich deoxyribonucleic acidhuang hua-bin， zhuang zhi-xia*，zhang wen-hua，hu jia，yang chao-yong，wang xiao-ru　(college of chemistry and chemical engineering，xiamen university，xiamen 361005)(first oceanography institute of state oceanic administration，peoples republic of china，qingdao 266061)(xiamen huaxia vocational college，xiamen 361024)abstract based on the selective permeability of cationic exchange membrane and the characteristic of electrical driven，a new and non-damage apparatus that can be used to separate compounds with different electric property was built to capture and enrich dna.λ-dna，as a model compound，was used to study the characteristic of capturing and enriching dna in this s that might affect the efficiency such as voltage and flow speed were optimized and gel electrophoresis was done to study if dna was denaturation，pcr was done to prove the concentration can be used to further s were got：the apparatus could used to capture and enrich dna scathelessly under the condition of low-voltage，the concentrate multiple was 62，and the recovery efficiency was accessible to 47%，concentration can be used for the next tic，easy to handle and little organic reagent using made it be advantageous，it could be miniatured to combine with other method had a large application space in field of dna extraction，purification and concentration.

　　keywords deoxyribonucleic acid capture；electrical driven；ion-exchange membrane；concentration

　　1 引言

　　核酸的提取和纯化在生物样品的基因分析实验中至关重要。Www.lw881.com传统的提取方法有酚-氯仿法，该方法设备要求较低，但有机溶剂毒性强，耗时且难以自动化。其它的诸如超声波法[1]，盐热法[2]，介电电泳法[3]等方法也由于各自的缺陷使其应用受到限制。近年来，利用脱氧核糖核酸（dna）与二氧化硅微球的氢键作用吸附提取dna的技术成为研究热点[4]，该方法克服了传统方法溶剂毒性、耗时、难以自动化的缺点，但微球的制备、灌注与芯片封装等步骤的工艺技术要求较高[4~7]。目前，膜分离技术越来越受重视，应用超滤和纳滤膜的筛选特性对不同分子量的生物样品进行分离的方法有很多报道[8]，而离子交换膜的应用主要在脱盐工业上，利用其截留特性进行生物样品尤其是生物大分子分离的应用报道较少。本实验结合电场的定向驱动特性和阳离子交换膜对负电性物质的截留，构建了一个无损伤的dna捕获浓缩装置，考察了其富集特性，并优化了实验条件。此方法在生物样品的分离纯化方面有较大的应用空间。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器和试剂

　　hl-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；稳压直流电源(上海力友电气公司)；powerpac basic凝胶电泳仪（bio-rad公司）；nd-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计(thermo公司)；凝胶成像系统（kadak公司）；pcr仪（bio-rad公司）；铂金电极，阳离子交换膜（nafion1135，dupont）。λ-dna（0.3 mg dna/ml，mbi）； taq dna 聚合酶（promega）； 琼脂糖（lp0028a，英国oxoid公司）； 脱氧核糖核酸（dntp，promega公司）； 溴化乙锭（sangon生物公司），其它试剂均为分析纯。超纯水由milli-q制得（r=18.2 mω）。

　　阴极缓冲液：te缓冲液(10 mmol/l tris-hcl，1 mmol/l edta-2na，ph 8.0)； 阳极缓冲液(1 mmol/l kh2po4+3.5 mmol/l k2hpo4+1 mmol/l na2so4，ph 9.0)。

　　λ-dna扩增片段包括101 bp，正引物5’-taa gca cga act cag cca gaa cga-3’，反引物5’-caa gct ttg cca cac cac ggt att-3’（promega公司）。

　　2.2 装置与原理

　　本简易装置综合利用流路死体积，电驱动特点和离子交换膜的截留特性。如图1，装置主要部件由玻璃拉制而成，膜借助卡套固定，恒流泵所用管路和接口为硅胶管，其它管路为聚四氟乙烯管，两电极之间的距离约5 cm。dna缓冲体系借助恒流泵从1处流入，流经捕获界面（支管口）时，负电性的dna分子在电场中向阳极方向迁移而进入竖直支管，到达阳离子交换膜时由于膜的截留特性，dna在膜附近堆积并避免了阳极的氧化作用。

　　图1 dna捕获浓缩装置示意图（略）

　　fig.1 general sketch of device used to capture dna

　　实验时，打开止水夹，向其中注入缓冲液，使膜上区域充满阴极缓冲液至支管口，确保支管中无气泡，关闭止水夹。注入阳极缓冲液并充满阳极区域，液面高于膜以确保膜附近无气泡。打开恒流泵，待液体流至阴极，开启稳压电源。待溶液全部流过支管口，关闭稳压电源，打开止水夹，收集浓缩液150 μl。实验结束用阴极缓冲液清洗管路。由于通电时间的延长，阳极缓冲溶液中阳离子浓度降低，需及时更新。实验中，当ph≤8.0时更换。膜使用前用阳极缓冲液浸泡。

　　2.3 实验方法

　　2.3.1 浓缩液的获取与测定 以te为空白，用nanodrop测定λ-dna在260 nm处的吸收值，并按照c=50a260求算出dna浓度为297 μg/l， 取20 μl λ-dna用阴极缓冲液（te）稀释至20 ml，浓度约为0.3 μg/l。按照装置与原理中的操作进行dna的捕获浓缩，泵流速为0.2 ml/min，工作电压200 v。收集150 μl浓缩液，用nanodrop测定a260，求算dna浓度。

　　2.3.2 浓缩液的凝胶电泳与聚合酶链反应（pcr） 配制30 ml 0.8%琼脂糖凝胶，溴化乙锭（eb）为染色剂，以19.0 μg/l标准λ-dna(未经浓缩装置)为参照物，进行凝胶电泳（1×tae电泳缓冲液，上样量10 μl，电压60 v，时间50 min），凝胶成像系统拍摄电泳图谱。

　　为证明浓缩液可用于进一步的分析，对浓缩液进行pcr实验。模板分别为空白（te）、19.0 μg/l标准λ-dna和250 v条件下收集的浓缩液进行pcr实验。热循环参数为：94 ℃预变性3 min；然后以94 ℃变性 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增20个循环；最后72 ℃延伸5 min使反应完全。反应完成后，取反应产物10 μl在3.0%琼脂糖凝胶上进行电泳（1×tae电泳缓冲液，电压70 v， 40 min），凝胶成像系统拍摄电泳图谱。25 μl pcr 反应体系中含有正反引物各0.01 μmol， dntp 5 μmol， 2.5 μl缓冲液(10×)， 0.25 μl taq dna 聚合酶及3.0 μl模板。

　　3 结果与讨论

　　3.1 dna溶液浓缩结果

　　浓缩前的稀释液浓度为0.3 μg/l，低于nanodrop的检出限（2 μg/l）， 而浓缩液在a260的吸收值为0.372，换算浓度为18.6μg/l，a260/a280为1.70。可见，本装置成功地实现dna分子的浓缩。富集倍数达到62倍，回收率为47%。图2为 nanodrop测定的稀释液与浓缩液的吸收光谱。购买的dna的a260/a280为1.79，浓缩液的比值略微下降，推测其原因为浓缩过程中缓冲体系中的阴离子向阳极区域迁移导致浓缩液的离子浓度较高，从而影响dna的检测。

　　图2 nanodrop测定的稀释液与浓缩液的吸收光谱（略）

　　fig.2 absorption spectra of diluent and concentrate by nanodrop

　　3.2 实验条件优化

　　流速越大，dna分子受到流体的力越大，在捕获界面停留的时间越短，进入支管的几率就越小。因此，可以通过降低恒流泵的流速提高富集效率。考察了流速在0.1，0.2，0.4和0.8 ml/min下dna的回收率。结果发现：流速越大，dna回收率越小。考虑到实验时间，流速选择为0.2 ml/min。工作电压越大，dna在电场中向阳极迁移的几率越大。考察了在400， 250和150 v电压下的回收率，结果发现：电压越高，浓缩液的a260越大（回收率越高）。但凝胶电泳的实验结果表明，当工作电压高于400 v后，不能得到电泳条带，推测其原因为电压过高导致dna的变性。因此，为防止浓缩过程中dna变性，实验选择250 v为工作电压。

　　3.3 无损伤检测

　　为研究实验过程中的dna是否发生断裂，进行了浓缩液的凝胶电泳实验。如图3所示，1为te空白，2为与浓缩液相近浓度的标准dna的电泳条带。3，4，5分别为工作电压为400，250，150 v时的浓缩液条带，由图中条带2与4亮度相近且无杂带可判断浓缩过程中的dna无断裂发生；条带4比5亮是因为4的dna浓度较高，而3无条带，主要原因是在较高电压条件下，浓缩液中的阴离子浓度增大，而高离子浓度溶液与高电压条件下产生的热效应都易使得dna变性，具体的变性机理还有待进一步的研究。本实验通过调节工作电压，实现了无损伤捕获浓缩dna分子。

　　为进一步证明浓缩液可用于生物分析，考察了浓缩液的pcr反应，产物的凝胶电泳如图4。结果表明，浓缩液可成功地扩增出目标片段（101 bp），可见本实验的浓缩液可用于进一步的生物分析。

　　图3 浓缩液的凝胶电泳图谱（略）

　　fig.3 0.8% agarose gel electrophoresis of dna

　　；2.λ-dna(19.0 mg/l)；trate (400 v)；trate(250 v)；trate (150 v).

　　图4 pcr产物的凝胶电泳图谱（略）

　　fig.4 3% agarose gel electrophoresis of pcr production of dna

　　1.50 bp marker；(te buffer)；3.λ-dna(19.0 g/l)；trate (250 v)．

　　4 结论

　　本实验成功地实现了dna无损伤的捕获浓缩，dna浓缩倍数62倍，富集效率50%，回收率约46%，浓缩液可用于进一步的生物分析。本方法较常规的方法操作简便自动，无须使用大量的有机试剂，进一步微型化可与生物芯片联用或集成于生物芯片，有望用于实际样品中的dna的提取或纯化。本装置也可用于一般无机离子或小分子极性有机物的预富集，降低痕量检测时对仪器检出限的要求

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