去甲氯胺酮半抗原及其全抗原的合成与鉴定

摘要】 在低温条件下，去甲氯胺酮与琥珀醛酸反应，合成了半抗原羧基-去甲氯胺酮，电喷雾质谱鉴定结果表明，目标半抗原合成成功；通过碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，红外光谱法鉴定结果表明，人工抗原合成成功，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定表明去甲氯胺酮半抗原与牛血清白蛋白的偶联比为11∶1。经动物免疫，获得高效价特异性多克隆抗体，抗血清效价可达5.12×104。

【关键词】 去甲氯胺酮； 半抗原； 人工抗原； 合成； 鉴定

synthesis and identification of hapten and　complete antigen of norketa mineyａｎｇ ting-ｔing， zｈａｏ chun-ｃheng，sｈｅｎ ｘiao-ｐing，tａｎ ｂo-ｃhang，zｏｕ ｐan-ｋun，wａｎｇ ｈuai- ｍing,lｉｕ ｌing-ｙun，wｅｉ ｃhao， ｗｅｉ ｗan-li，he jin-hai，wu jie，zhang dong-sheng，zｈａｏ ｘiao-ｌian（jiangsu suwei microbiology research co.，ltd.， wuxi 214063)(wuxi municipal public security bureau，wuxi 214002)(zhenjiang municipal public security bureau，zhenjiang 212001)(jiangyin municipal public security bureau，jiangyin 214405)yancheng municipal public security bureau，yancheng 224001)　abstract under low temperature conditions，the hapten carboxyl-norketamine was synthesized by reacting norketamine and succinaldehyde fication result using electrospray ionization mass showed the hapten was successfully artificial antigen confirmed by infrared spectroscopy was developed by conjugating hapten to carrier proteins with carbodiimide(edc) -assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(maldi-tof-ms) showed that the ratio of hapten to bsa was 11∶ antibody with high titer(5.12×104) was produced after immuning to rabbits.

　　keywords norketamine；hapten；artificial antigen；identification

　　1 引言

　　氯胺酮（ketamine，ket）是一种通过静脉给药的短效麻醉剂，其进入血循环后大部分进入脑组织，然后再分布于全身组织中，肝、肺和脂肪内的药物浓度也较高。由于ket是毒品“k粉”的主要成分，近年来，其非法滥用现象严重。由于ket代谢的半衰期较短，摄入体内后，代谢生成去甲基氯胺酮(norketa mine，nket)、去氢去甲基氯胺酮(dehydronorketamine，dhnk)，因此在生物检材（如血液、尿液、毛发等）中代谢物的含量比较高[1,2]，作为检测指标，ket代谢物(主要是nket)的检测比ket的检测更加重要，而且对嫌疑人是否吸食ket的确认更加有效。目前，检测ket及其代谢物的分析方法主要有：气相色谱法（gc）、气-质联用法（gc-ms）、高效液相色谱法（hplc）、液-质联用法（lc-ms）、高效毛细管电泳法（hpce）酶联免疫吸附法（elisa）等[3~11]。由于常规仪器分析不适于批量样品的筛选检测，关于nket的免疫分析技术国内迄今尚未见相关报道。本文设计合成了nket的半抗原，并与牛血清白蛋白（bsa）和卵清蛋白（ova）偶联得到人工抗原，经免疫新西兰大白兔后，获得高效价的特异性多克隆抗体，为建立nket的免疫学检测方法提供了强有力的技术支持。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　spectronic 1.70紫外可见光分光光度计（意大利gbc公司）；nexus 670型傅立叶变换红外光谱仪（nicolet公司）；voyager de str基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（美国应用生物系统公司）； mk3酶标仪（雷勃公司）。去甲氯胺酮标准品（英国tocris公司）；牛血清白蛋白（bsa，sigma公司）、卵清蛋白（ova，sigma公司）；弗氏完全、不完全佐剂（北京生物制品研究所）；四甲基联苯胺（tmb）、羊抗兔igg（北京博奥森有限公司）；其他试剂均为分析纯。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 半抗原合成 取10 mg nket、3 mg氰基硼氢化钠（nabh3cn）或40 μl 15%琥珀醛酸溶液，分别加入6，1和1 ml混合溶剂(四氢呋喃-吡啶为5∶1， ｖ／ｖ）至完全溶解，于4 ℃冰箱放置备用；将琥珀醛酸溶液逐滴加入到nket溶液中，4 ℃下磁力搅拌，反应5 min；再逐滴加入nabh3cn溶液，将反应混合物在4 ℃下磁力搅拌2~3 h，直至反应完全后，将反应物低温（40 ℃）旋转蒸发至干，所得产物即为nket半抗原（羧基-nket）。

　　2.2.2 人工抗原的合成 取上述nket半抗原13.8 mg，溶于1 ml n,n-二甲基甲酰胺（dmf）溶液中，滴加50 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc，溶于0.5 ml h2o），搅拌反应20 min后，将该反应液滴加至20 mg bsa（溶于10 ml h2o中）立即加入52 mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺（sulfo-nhs），室温下搅拌过夜。pbs透析48 h，冷冻干燥。包被抗原（nket-ova）的合成方法同上。合成路线见图解1。

　　图解1 去甲氯胺酮人工抗原合成路线（略）

　　scheme 1 reaction scheme of synthesis for norketamine(nket) antigen

　　2.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定 所得的nket半抗原和免疫抗原（nket-bsa）的分子结构鉴定分别采用质谱法（ms-esi）和红外光谱法（ir）确证。

　　2.2.4 抗体制备及效价测定 以偶联物nket-bsa为免疫抗原免疫雄性新西兰大白兔，1 mg/kg体重。基础免疫采用背部皮下多点注射，加强免疫采用四肢内部肌肉注射，间接酶联免疫吸附法（ielisa）测定效价合格后，颈动脉放血，分离抗血清，采用饱和硫酸铵沉淀法[7]纯化抗体，制成冻干粉，于－20℃保存。采用elisa法测定纯化抗体的效价。

　　3 结果与讨论

　　3.1 半抗原分子结构的鉴定

　　经lc-ms法（如图1）分析得出，lc图谱中8.71 min对应的峰是过剩的反应物，而9.45 min对应的峰经ms法分析结果可知，分子离子峰m/z 312（[310+2h]+），分子离子峰m/z 308（[310－2h]－），因此，质谱分析结果初步说明反应产物为目标化合物，即nket半抗原。

　　图１ nket半抗原的hplc-ms图谱（略）

　　fig.１ hplc-ms spectrum of nket hapten

　　3.2 人工抗原nket-bsa结构鉴定

　　采用固体kbr压片，对nket-bsa冻干粉、bsa和nket进行ir测定。如图２所示。通过比较bsa和nket-bsa的红外吸收光谱发现，在2800~3400 cm－1区域以及1500~1700 cm－1区域具有相似的吸收，此为蛋白质中氨基酸的特征吸收，说明合成的nket-bsa化合物具有bsa的特征官能团。将nket-bsa与nket的红外光谱进行比较，在600~1200 cm－1之间，出现了明显的nket半抗原特征峰,而bsa在此处无明显吸收，说明nket-bsa具有nket的特征官能团,基本判断nket-bsa人工免疫原已经合成成功。

　　图２ nket，nket-bsa及bsa的ir图谱（略）

　　fig.２ ir spectra of nket，nket-bsa and bsa

　　3.3 人工抗原偶联比的测定

　　将所得免疫抗原（nket-bsa）通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（maldi-tof-ms）进行偶联比的测定得测定偶联物分子量约为68685 da，计算得1分子bsa约与11分子nket半抗原偶联，即nket半抗原与bsa的偶联比为11∶1。

　　3.4 抗体效价

　　根据方阵滴定原理，采用间接elisa法测定抗nket抗体的效价。当包被抗原浓度为2.0 mg/l时，抗血清效价可达5.12×104。

　　本研究选择从氨基部位进行衍生化，以琥珀醛酸作为衍生剂，以混合溶剂（四氢呋喃-吡啶， 5∶1， v/v）作为反应溶剂，低温反应得到产物。研究结果表明，本方法是一种新的nket半抗原合成方法，能够满足实验室少量合成半抗原的需要。人工抗原nket-bsa的合成，采用碳二亚胺法，经两步反应得到偶联物，并通过ir和maldi-tof-ms进行了鉴定。经动物免疫获得抗nket的多克隆抗体，当包被抗原浓度为2.0 mg/l时，抗血清效价可达5.12×104。

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