乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建

【摘要】 目的：构建人乳头瘤病毒16l1的原核表达质粒，为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床hpv16阳性标本为模板，pcr扩增l1的片段，l1片段经ecorⅰ和salⅰ双酶切后,插入载体pgex4t1，转化jm109感受态细胞，平板筛选获得pgex4t1/hpv l1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pgex4t1/hpv16l1，并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pgex4t1/hpvl1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础，为hpv16的疫苗研究提供了有益的支持。

【关键词】 人乳头瘤病毒16；质粒；构建

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有37万新发病例，有20万妇女死于宫颈癌。近年来，人乳头瘤病毒（human papillomaviruses，hpv）感染被认为与大多数宫颈癌发生和发展密切相关[1]。据报道，99%以上的宫颈部位肿瘤可检测到hpv dna的存在。因此,研究hpv疫苗对于宫颈癌的预防和治疗具有重要作用。迄今已发现的乳头瘤病毒多达100多型，其中hpv16与宫颈癌关系最为密切。hpv癌蛋白e5、e6、e7具有刺激生长和转化功能[2,3]。e5是细胞膜或内膜整合蛋白。在感染细胞克隆早期的繁殖、扩张中起重要作用。hpv的外壳蛋白l1是保护性抗原,具有较强的保守性：在选择压力等外界作用下变异很小。不同型别蛋白氨基酸序列同源性高达60%。本课题选择hpv16的保护性抗原l1所在基因片段为目标，构建原核表达质粒，为获得具有预防宫颈癌作用的蛋白作准备。

1材料

主要仪器有凝胶成像仪购自media cybernetics（usa）公司，电泳仪购自biomad公司。主要试剂：premixtag,限制性内切酶ecorⅰ和salⅰ、t4 dna连接酶为takara产品,dna相对分子质量标准(dl2000)为北京天为时代科技有限公司产品,dna相对分子质量标准λdna/hindⅲ为takara产品,胶回收使用上海华舜生物公司试剂盒gel extraction min kit。质粒提取使用omega公司的e.z.n.a plasmid mininprep kitⅰ。hpv16阳性患者子宫颈细胞来自四川大学华西妇产儿童医院。大肠杆菌jm109购自takara 公司。pgex4t1质粒由本室保存。

2方法

2.1hpv16l1基因扩增根据genbank中查得的东亚型hpv16全基因序列(基因登陆号af534061)设计扩增hpv16 l1基因的上下游引物。上游引物5'gcggaattcatgcaggtgacttttatttaca3'，下游引物5'gcggtcgactaaaaatttgcgtcctaaag3'上、下游引物5’端分别设有ecorⅰ和salⅰ酶切位点，所扩增的目的片段长度为1485 bp，引物合成由上海invitrogen生物工程公司完成。以hpv16阳性子宫颈细胞dna为模板克隆hpv16 l1基因。pcr扩增条件为94℃预变性4min，变性94℃30s,退火53℃35s,延伸72℃1.5min,最后72℃10 min后终止反应。

2.2hpv16l1原核表达质粒的构建对pcr产物和pgex4t1载体分别用ecorⅰ、salⅰ双酶切和琼脂糖电泳回收目的片段，经t4连接酶16℃过夜连接hpv16l1和pgex4t1。连接产物转化感受态细胞jm109，amp平板筛选阳性克隆。阳性克隆经ecorⅰ、salⅰ双酶切和pcr鉴定，获得初步正确的克隆。将该克隆送takara公司测序。

3结果

3.1pcr扩增hpvl1蛋白基因以hpv16阳性子宫颈细胞dna为模板，用l1基因的特异引物进行pcr反应，pcr产物琼脂糖电泳结果见图1。可见，2000bp与1000bp中间处有一明显条带，大小与预期值相符（1485bp）。

3.2 重组质粒酶切鉴定转化jm109之后，阳性菌落经ecorⅰ或salⅰ单酶切鉴定显示，产物为约5500bp的单一片段；用ecori和salⅰ双酶切鉴定显示，产物为约5000bp和约1500bp的两个片段。结果表明，重组质粒单酶切的片段大小与理论值相符（5454），双酶切后的大片段为载体片段，小片段为插入片段，均与理论值相符（大4969bp，小1485bp）。电泳结果见图2。

3.3重组质粒插入基因的序列测定利用pgex4t1通用引物对重组质粒的插入片段进行测序，结果显示重组质粒中插入的目的片段l1基因与genbank报告的序列和氨基酸序相同，而且l1基因插入到真核表达载体中，插入的方向正确，未改变外源基因的阅读框架。进一步证实了重组质粒为阳性重组子。

4讨论

hpv型别繁多，有100多种，其中以hpv16在子宫颈癌中最为常见，占全部hpv的50%以上，其次是hpv18，约占18%[4]。有文章报道hpv16感染患者发生子宫颈癌的危险是无感染者的506倍[5]。

hpv是具有特异性嗜上皮细胞的dna病毒,其基因主要包括e1e7早期基因和l1、l2晚期基因，前者主要是调控基因，具有转化作用。l1、l2是结构蛋白，具有强的抗原性，为预防性疫苗研究的热点。

本研究选择hpv16东亚型的保护性抗原l1为目的基因，构建了其原核表达质粒pgex4t1/hpvl1，通过酶切，测序等方法验证了其正确性，为下一步hpv16l1蛋白的表达奠定了坚实的基础，为hpv16l1的保护性疫苗的研究提供了有益的支持。

【参考文献】
1 bosch fx, lorincz a, nuroz n, et al. the causal relation between human papillomavirus and cervical cancer[j]. j clin pathol, 2002, 55(4): 244265.

2 psyrri a, defilippis ra, edwards apb, et al. role of the retinoblastoma pathway in senescence triggered by repression of the human papillomavirus e7 protein in cervical carcinoma cells[j]. cancer res,2004, 64(9): 30793081.

3 nguyen dx, westbrook tf, mccance dj. human papillomavirus type16 e7 maintains elevated levels of the cdc25a tyrosine phosphatase during deregulation of cell cycle arrest[j].virol, 2002, 76(2): 619633.

4 mandeblatt js, lawrence wf. gaffikin costs and benefits of different strategies to screen for cervical cancer in lessdeveloped countries[j]. j natl cancer inst, 2002, 94(19): 14961503.

5 franceschi s. strategies to reduce the risk of virusrelated cancers[j]. annals of oncology, 2000, 11(9):10911096.