湖南大围子猪SLADR基因克隆及其生物信息学分析

【摘要】 目的: 研究湖南大围子猪sladr基因特性, 评价该猪种在异种器官移植中是否具有应用前景。方法: 应用rtpcr扩增大围子猪sladra和sladrb基因, 插入pucmt载体, 双向测序, 用ncbi中的blast和expasy软件进行生物信息学分析。结果: 大围子猪sladra和sladrb基因扩增片段大小分别为1 177 bp和909 bp, 均包含完整的开放阅读框, 分别编码252和266个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明, 大围子猪sladra和sladrb与人类相应的dra、 drb相比, 氨基酸同源性分别为82%和73%。sla dr α链与人cd4 分子结合部位介于第124 至136 位氨基酸, 大围子猪sladra在该结合区域与人类相应的dra存在两个氨基酸差异, 即: 第127位(lle→val), 第136位(ser→thr); sla dr β链与人cd4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸, 大围子猪sladrb在该结合区域与人类相应的drb相比氨基酸序列完全相同。与国际genbank 已登录的许多猪种相比, sladra基因同源性高达100%, 而sladrb基因在各猪种之间具有很高的多态性。结论: 克隆湖南大围子猪sladra和sladrb基因, 该基因与人类相应的hladra和hladrb基因高度同源, 提示该猪种有望作为异种移植的候选供体。

【关键词】 sladr基因; 湖南大围子猪; 基因克隆; 异种移植

cloning and bioinformatics analysis of sladr genes in hunan daweizi pigs

　　wang yan1, xing xiaowei1△, xue liqun2, huang shengqiang2, wu xiaoli1, wang wei1*

　　1cell transplantation & gene therapy center, third xiangya hospital of central south university, changsha 410013; 2department of animal science and technology, hunan agriculture university, changsha 410128, china

　　[abstract] aim: to evaluate the potential of daweizi pigs as xenotransplantation dnors from pigs to humans by analyzing the characteristics of sladr genes in hunan daweizi pigs. methods: sladra and sladrb genes were amplified by rtpcr, cloned into pucmt vectors, sequenced and analyzed through blast in ncbi and related software in expasy. results: the sladra and sladrb genes were 1 177 bp and 909 bp nucleotides in length, which contain opening reading frame (orf) and encode 252 and 266 amino acids respectively. comparing the sladra and sladrb genes with their counterpart sequences of human, the homologies of amino acid sequences were 82% and 73% respectively. the amino acids in sla dr α chain of daweizi pigs from position 124 to 136, which bind to human cd4, showed only two differences with hla dra: a lle→val change at position 127 and a ser→thr change at position 136. the amino acids in sla dr β chain of daweizi pigs from position 134 to 148, which bind to human cd4, were identical with hladrb. further comparison with sla sequences published in genbank indicated that sladrb gene found in daweizi pigs has polymorphism while the homology of sladra gene is up to 100%. conclusion: the cloned sladra and sladrb in hunan daweizi pigs has high polymorphism with hladra and hladrb in human, indicates that daweizi pigs have some advantages as xenotransplantation dnors from pigs to humans.

　　[keywords]swine leukocyte antigen dr allele (sladr); daweizi pigs; gene cloning; xenotransplantation

同种异体器官移植已成为治疗终末期器官衰竭的一种有效手段, 猪被认为是异种移植最理想的供体来源[1]。WWW.lw881.com然而, 如何解决免疫排斥问题仍是阻碍临床大规模应用的主要问题之一[2]。猪的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex, mhc), 又称作猪白细胞抗原(swine leukocte antigen, sla), 是由紧密连锁的高度多态基因座所组成的染色体的一个遗传区域, 它作为主要组织抗原, 参与移植排斥反应, 是引起异种移植急性细胞性排斥的主要遗传因素[3]。通过对供体猪种进行筛查, 尽可能选择与人类mhc同源性较高的猪种将有助于提高异种移植物在人体内的存活时间, 为临床大规模开展将猪器官或细胞异种移植到人提供理想的供体猪种来源。

　　中国具有丰富的猪种种质资源, 不同的地域分布形成了猪种的多样性和遗传的相对稳定性, 为异种移植提供了可贵的研究和利用资源[4]。湖南大围子猪是我国特有的地方猪种之一, 亦是湖南省著名地方优良猪种, 具有繁殖力强、 抗逆性强、 耐粗饲、 肉质好、 生长慢、 饲料效率高等种质性状。但是, 大围子猪能否作为异种移植的供体, 尤其是该猪种细胞表面sla特性如何, 目前尚不清楚。本研究将克隆湖南大围子猪sladr基因, 分析其sladra和sladrb基因特性, 比较与人cd4 分子结合部位大围子猪sladr编码氨基酸与人类相应dra、 drb的同源性, 为评价湖南大围子猪在异种移植中的应用前景, 提供免疫学方面的依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 总rna抽提试剂盒购自美国gentra公司; cdna第一链合成试剂盒购自fermentas 公司; pucmt载体、 引物、 电泳试剂等购自上海生工生物工程技术服务有限公司; pcr高保真克隆酶easya购自stratagene公司; dna marker(100 bp ladder)购自晶美生物工程公司; 湖南大围子猪来自湖南望城大围子猪保种基地。

　　1.2 方法

　　1.2.1 湖南大围子猪sladra和sladrb基因引物设计 根据genbank数据库中已登录的明尼苏达小型猪(minnesota miniature swine)的sladr序列(登录号为m93028, ab205163), 采用pcrdesn软件设计以下引物。sladra: 上游引物 : 5′ggc atc taa gga gaa aat gac3′; 下游引物: 5′cca ctc aaa gtt tat tgt att cag3′, 预计扩增片段大小为1 177 bp; sladrb: 上游引物: 5′ttg tcc tct cct gtt ctc cag3′; 下游引物: 5′tag gac gca gag cat agc agg3′, 预计扩增片段大小为909 bp。

　　1.2.2 rtpcr扩增湖南大围子猪sladra和sladrb基因 在湖南大围子猪保种群中随机挑选两头个体, 以700 ml/l乙醇消毒耳尖取耳样组织, 按rna抽提试剂盒(gentra公司)说明书方法提取总rna。测定每一样品总rna的浓度, 模板定量为1 μg rna, 按revertaidtm first strand cdna synthesis kit说明书方法逆转录合成cdna第一链。以合成的cdna为模板进行pcr扩增, 20 μl pcr反应体系中, 分别加入下列物质: depc处理水13.5 μl, pcr缓冲液2 μl, 25 mmol/l mgcl2 1.6 μl, 10 mmol/l dntp混合物0.5 μl, 50 mmol/l上、 下游引物各0.2 μl, 模板1.6 μl, easya 高保真酶0.4 μl。在pe9700 型pcr 扩增仪上完成pcr扩增, 扩增条件如下: 先95℃预变性2 min 30 s, 94℃变性40 s, 58℃～59℃退火40 s, 72℃延伸40 s, 完成35个循环, 最后72℃延伸5 min, 置 4℃保温。取3.5 μl pcr扩增产物, 1.5 g/l琼脂糖凝胶电泳, 以鉴定pcr扩增结果。

　　1.2.3 湖南大围子猪sladra和sladrb基因克隆与鉴定 连接反应在10 μl体系中进行: 双蒸水3 μl、 pcr产物1 μl、 pucmt载体1 μl混匀后加入5 μl solutionⅰ, 16℃水浴连接过夜, 转化感受态大肠杆菌jm109(采用cacl2法制备), 4℃静置30 min后放入42℃水浴中热休克90 s, 加入300 μl预热的lb培养基, 37℃下振荡培养(200 r/min) 45 min, 将菌液平铺于含氨苄青霉素的固体培养基上, 37℃恒温箱中培养过夜。挑取单克隆, 在含氨苄青霉素200 mg/l的液体lb培养基中培养, 以菌液为模板, pcr鉴定为阳性克隆, 抽提质粒, 送上海英骏生物技术有限公司双向测序。

　　1.2.4 湖南大围子猪sladra和sladrb基因生物信息学分析 用ncbi homepage中的orf对湖南大围子猪sladra和sladrb基因的开放阅读框进行识别; 用expasy服务器中的prosite scan软件对sladra和sladrb基因的功能域进行预测; 用ncbi中的blast及expasy服务器中的clustalw等软件对获得的sladra和sladrb基因的序列结构进行比较分析。

　　2 结果

　　2.1 湖南大围子猪sladra和sladrb基因rtpcr扩增结果 rtpcr扩增结果显示, 两头湖南大围子猪sladra和sladrb均有特异性扩增条带, 大小分别为1 177 bp和909 bp, 与预期扩增片段大小一致(图1)。

　　2.2 湖南大围子猪sladra基因测序结果 测序大围子猪sladra基因, 结果表明: 来源于两个不同个体的sladra基因序列是一致的, 其cdna全长均为1 177 bp, 包含一个759 bp的完整的开放阅读框, 推测编码252个氨基酸。生物信息分析发现, sladra第1～23 位氨基酸为信号肽, 第24～107位氨基酸为α1 功能区, 第108～202位氨基酸为α2 功能区, 第203～252位氨基酸为穿膜和胞浆功能区。推测sladra蛋白中有1个camp和cgmp依赖的蛋白激酶磷酸化位点, 6个n肉蔻酰化位点, 2个n糖基化位点, 2个蛋白激酶c磷酸化位点, 1个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点。

　　2.3 湖南大围子猪sladrb测序结果 测序大围子猪sladrb基因, 结果表明: 来源于两个不同个体的sladrb基因序列是一致的, 其cdna 全长为909 bp, 包含一个完整的开放阅读框, 大小为801 bp, 推测编码266个氨基酸。生物信息分析发现, sladrb蛋白序列第1～29 位氨基酸为信号肽, 第30～123 位氨基酸为α1 功能区, 第124～217 位氨基酸为α2 功能区, 第218～266位氨基酸为穿膜和胞质功能区。推测sladrb蛋白包括3个n肉蔻酰化位点, 1个n糖基化位点, 3个蛋白激酶c磷酸化位点, 1个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点。

　　2.4 湖南大围子猪sladr与人类相应hladr同源性比较 大围子猪sladra与人类的hla dra(bc071659)相比较, 在核苷酸水平同源性为88%, 编码的氨基酸序列同源性为82%。sla dr α链与人cd4 分子结合部位介于第124至136位氨基酸, 大围子猪sladra在此结合区域与人类相应的dra存在两个氨基酸差异, 即: 第127 位(val→lle), 第136位(thr→ser)(图2)。

　　大围子猪sladrb与人类的hladrb*09012(ay622551)相比较, 在核苷酸水平同源性为82%, 编码的氨基酸序列同源性为73%。sla dr β 链与人cd4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸, 大围子猪sladrb在此结合区域与人类相应的drb相比氨基酸序列源性为100%(图3)。

　　2.5 湖南大围子猪sladr基因与genbank里其它猪种序列同源性比较 大围子猪与nih小型猪d单倍型(m93028)、 湖南沙子岭猪(ef143987) sladra编码的氨基酸同源性为100%, 与genbank里已发表的其它猪种的相应基因比较, 同源性高达99%以上。大围子猪sladrb基因与genbank登录的许多猪种核苷酸和氨基酸序列同源性分别是93%～95%, 89%～95%, 并根据氨基酸比较结果建立种系进化树(图4)。

　　3 讨论

　　免疫排斥反应仍是目前异种移植面临的最大难题, 其中供受体组织相容性是研究异种移植排斥反应的关键问题。因此, 组织相容性复合物即白细胞抗原是筛选供体时必须考虑的因素。异种猪抗原(主要是猪白细胞抗原sla)是引起异种移植t淋巴细胞介导的急性细胞性排斥反应的主要遗传因素[2]。sla被人t淋巴细胞识别存在直接识别和间接识别途径[3]。在直接识别途径中, 猪slaⅱ类抗原经自身抗原提呈细胞(apc)处理, 提呈给人cd4+t辅助细胞参与免疫排斥反应。人t细胞对猪异种抗原的间接识别是指猪的异种抗原以外源性蛋白质抗原的方式为人apc摄取、 加工后, 引起人特异性cd4+ t细胞的激活与效应。在异种移植细胞性排斥反应中, 异种抗原被人t细胞识别到底哪种识别途径占优势目前尚不清楚。andres等[5]认为在异种胰岛移植中, 种系差异越小直接识别途径占优势, 种系差异越大、 间接识别途径占优势。因此, 对slaⅱ类基因的深入研究将有助于猪人异种器官移植的供受体配型选择, 有助于攻克异种移植排斥反应, 筛选异种移植供体。

　　目前, 国内外都积极致力于研究各猪种的sla, 筛选异种移植供体, 更好的为异种移植应用于临床服务。国外对yucatan小型猪[6]、 westran猪[7]等, 国内对中国西双版纳微型猪[8]、 湖南沙子岭猪[9]、 广西猪、 贵州香猪、 云南小耳猪[10, 11]等猪种作为研究模型, 通过克隆、 测序分析sla基因, 研究sla在异种移植排斥反应的发生机制中的作用。吴群等[12]对中国海南五指山猪进行研究, 指出五指山猪种在与人类mhc遗传基因水平相似性方面有一定优势; 在与人cd4相结合部位, 五指山猪sladrb参与结合的关键氨基酸残基与人类完全相同, 并且通过基因工程对五指山猪sladra分子两个不同的氨基酸残基进行必要的修饰和改造, 使其成为理想的异种移植供体。

　　湖南大围子猪是湖南省著名的地方优良猪种, 具有繁殖力强、 抗逆性强、 耐粗饲、 肉质好、 生长慢、 饲料效率高等种质性状。本研究首次克隆湖南大围子猪的sladra和sladrb序列。sla位于猪的第七号染色体, 由i类、 ⅱ类和ⅲ类3个基因簇组成。slai类基因和slaⅲ类基位于7号染色体的短臂, slaⅱ类基因则位于染色体长臂上。研究表明: slaⅱ类抗原的基因主要有β链基因和α链基因两种, 分别编码slai类抗原的β肽链和α肽链。编码slaⅱ类抗原β链的基因座sladr和sladq已被证明存在显著的等位基因多态性, 而这种多态性与slaⅱ类抗原的生物学特性又是密切相关。生物信息分析发现, sladra基因为高度保守序列, 各猪种间dra基因同源性高达99%以上, 而sladrb基因在各猪种间具有丰富的多态性, 这一结论与文献报道一致。

　　大围子猪sladra 和sladrb 与人类相应的dra、 drb相比, 氨基酸同源性分别为82%和73%。人cd4分子在排斥反应中发挥重要作用, sla dr α链与人cd4 分子结合部位介于第124～136 位氨基酸, 大围子猪sladra在该结合区域与人类相应的dra存在两个氨基酸差异, 即: 第127 位(lle→val), 第136 位(ser→thr); sla dr β链与人cd4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸, 大围子猪sladrb在该结合区域与人类相应的drb相比氨基酸序列同源性为100%。该结果说明, 湖南大围子猪sladr基因与人的相应基因组织相容性较好, 可在异种移植排斥反应中以直接识别途径即人cd4+t细胞直接识别猪细胞表面的slaⅱ分子。

　　总之, 通过本研究首次成功克隆了湖南大围子猪sladra 和sladrb基因序列, 发现该猪种与人类相应的dra和drb有高度同源性, 在免疫学特性方面具有一定的优势, 提示该猪种可作为异种移植侯选供体。

【参考文献】
　　[1] kazuhiko yamada, adam griesemer, masayoshi okumi. pigs as xenogeneic donors[j]. transplantation reviews, 2005, 19(3): 164-177.

　　[2] sprangers b, waer m, billiau ad. xenotransplantation: where are we in 2008?[j]. kidney international, 2008, 74(1): 14-21.

　　[3] vincenzo mirenda, dela golshayan, joseph read, et al. achieving permanent survival of islet xenografts by independent manipulation of direct and indirect tcell responses[j]. diabetes, 2005, 54: 1048-1055.

　　[4] 李幼平, 何秋明, 蔡绍晖, 等. 异种移植与中国地方猪种资源的利用[j]. 中国修复重建外科杂志, 1998, 13(1): 43-46.

　　[5] andres a, toso c, morel p, et al. phylogenetic disparity influences the predominance of direct over indirect pathway of antigen presentation in islet xenotransplantation[j]. transplantation proceedings, 2005, 37(1): 463-465.

　　[6] smith m, martens w, ho s, et al. dna sequence based typing of swine leukocyte antigens in yucatan miniature pigs[j]. xenotransplantation, 2005, 12(6): 481-488.

　　[7] lee jh, simond d, walters s, et al. characterization of the swine major histocom patibility complex alleles at eight loci in westran pigs[j]. xenotransplantation, 2005, 12(4): 303-307.

　　[8] 曾 嵘, 苗永旺, 霍金龙, 等. 微型猪近交系133家系sladq cdna的克隆和序列分析[j]. 中国实验动物学报, 2005, 13 (4): 215-221.

　　[9] 唐医亚, 邢晓为, 薛立群, 等. 湖南沙子岭猪sladr基因克隆及生物信息学分析[j]. 遗传, 2007, 29(12): 1491-1496.

　　[10] 陈福祥, 谢 晋, 周光炎. 中国猪种sladr基因的克隆及序列分析[j]. 上海免疫学杂志, 2002, 22(3): 157-162.