高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量

【摘要】 目的：建立多花黄精多糖的分子量与分子量分布分析方法。方法：应用高效凝胶渗透色谱法，色谱柱为shodex ohpak sb803hq（8 mm×300 mm），流动相为0.71%硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮钠），柱温：35 ℃，示差折光检测器（检测器温度35 ℃），流速0.5 ml·min-1。结果：根据建立的方法测定，得到多糖的高效凝胶色谱图，计算出多花黄精多糖的重均分子量及其分布。结论：所用方法简便、快速、准确，可用于多花黄精多糖的质量控制。

【关键词】 高效凝胶色谱法； 多花黄精多糖； 分子量及其分布

多花黄精多糖是从传统中药百合科植物多花黄精中发现并分离出一种低分子量活性多糖，为新药(中药)原二类,全国第一个治疗病毒性角膜炎的中药。多花黄精多糖抗单纯疱疹病毒i型的体外细胞培养试验结果结果表明,多花黄精多糖有明显的抗单纯疱疹病毒i型的作用。多糖为单糖的天然聚合物，多糖的性质和药理作用与其分子量大小，分子量分布及其结构密切相关。多糖的分子量不是均一的，具多分散性，需要用统计方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝胶色谱法测定多糖的分子量及其分布，具有快速，重现性好等优点，在国内外得到了广泛的应用[1]。多花黄精多糖为水溶性多糖，针对其单糖组成和空间结构与葡聚糖相似，在色谱柱的选择上倾向于更适合于水溶性多糖分离测定用的shodex ohpak sb803hq系列（对葡聚糖的排阻极限为1×105）。有关多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布尚未见相关报道，本文应用凝胶渗透色谱（gpc）法测定多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布[2]，为考察生产工艺的稳定一致性及控制产品质量提供了科学依据，为多花黄精多糖分子大小和药理作用的相关性研究打下了一定基础。

1实验部分

1.1仪器与试药

agilent 1100型高效液相色谱仪（自动进样器），示差折光检测器。shodex ohpak sb803hq凝胶色谱柱。北京龙智达公司提供gpc专用软件。

供分子量测定用右旋糖酐分子量标准对照品（中国药品生物制品检定所提供，d0、d1、d2、d3、d5、d6、d8、d2000分子量依次为180、2500、4600、7100、21400、41100、133800、2000000）；其余试剂均为分析纯；高纯水用milliporeq超纯水系统制得。

试验用样品多花黄精多糖由四川泰华堂制药有限公司提供。

1.2方法与结果

1.2.1色谱条件色谱柱为shodex ohpak sb803hq，流动相为0.71%硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮钠），柱温：35 ℃，示差折光检测器（检测器温度35 ℃），流速0.5 ml·min－1，取供试品溶液及对照品溶液各20μl注入液相色谱仪。

1.2.2溶液的制备取多花黄精多糖适量，加流动相制成每1 ml中约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。另取d0，d2000及4～6个已知分子量的葡聚糖对照品，同法制成每1ml中各含10 mg的溶液作为对照品溶液。

1.2.2.5系统适应性试验取葡萄糖对照品溶液（d0），按1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，按葡萄糖峰计算理论塔板数n=5.54×trw1/2=16083；另取d2000对照品溶液，1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，计算分配系数，kd=trt0ttt0=0.52，kd在0～1之间，符合中国药典2005年版的要求。式中tr为供试品峰保留时间，t0为蓝色葡聚糖（d2000）峰保留时间，tt为葡萄糖（d0）峰保留时间。

1.2.3标准曲线的制备及样品测定

取上述右旋糖酐系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由gpc专用软件绘制标准曲线，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得回归方程。该方法的标准校正曲线线性良好，相关系数达0.9997。根据gpc专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用gpc专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。 表1 右旋糖酐分子量标准对照品保留时间及其相应的对数值

　　1.2.4 精密度试验取供试品溶液20 μl，按“1.2.1”项下色谱条件，连续测定5次，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5018，5009，5009，5028，5017，rsd为0.16%，表明该系统测定样品分子量的精密度良好。

1.2.5重复性试验取批号为060701的样品，按“1.2.2”项下方法分别制备供试品溶液5份，按“1.2.1”项下色谱条件测定分子量及其分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5020，5028，5044，5054，5053，rsd为0.30%。表明该分析方法测定样品分子量精密度良好。

1.2.6稳定性试验取同一供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件，在0h、2h、4h、8h、12h和24h分别进样，测定分子量及分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5055，5090，5100，5126，5160、5046，rsd为0.84%。表明供试品溶液在24小时内稳定。

1.2.7样品的测定取不同批号的多花黄精多糖样品，按“1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，然后按“1.2.1”项下的色谱条件测定分子量及分子量分布，结果见表2。表2 3 批样品重均分子量及其分布情况表

　　2讨论

　 根据以上测定结果可见，测定的三批多花黄精多糖的重均分子量分布在2500～7500之间，分布宽度小于2.0。用本方法测定多花黄精多糖的分子量与分子量分布，准确可行，简便快捷，精密度好。

分布宽度的引入，使多花黄精多糖的分子量分布更具可控性，能够通过检测该指标反映生产该样品的工艺的变化以及样品质量的变化，使得样品的质量更具有可控性。

【参考文献】
1 董晓蓉.高效液相色谱法测定蔗糖铁注射液中蔗糖铁的分子量与分子量分布[j]. 药物鉴定，2006，15（4）：19-21.