MMP2和TIMP2在脂多糖诱导的新生大鼠急性肺损

【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶2(matrix metallo proteinase2，mmp2)及其组织抑制剂(tissue inhibitors of metallo proteinase2，timp2)在脂多糖（lps）诱导的新生大鼠急性肺损伤中的作用。方法 选择30只新生7日龄sd大鼠，随机分为生理盐水对照组（n=6）和急性肺损伤组（n=24）,后者进一步分为1、2、4及6h亚组，每组6只。以lps 腹腔注射建立急性肺损伤模型，观察注射lps后不同时间点大鼠肺组织的病理改变，用免疫组织化学法和逆转录聚合酶链反应（rtpcr）法检测大鼠肺组织中mmp2和timp2的蛋白及mrna表达。结果 病理学检查证实新生大鼠急性肺损伤模型复制成功。与生理盐水对照组比较,急性肺损伤组注射lps后mmp2蛋白及mrna均表达增加,4～6h达高峰，差异有统计学意义（均p<0.05）。timp2蛋白及mrna表达 在6h内可见微弱增加趋势，但与生理盐水对照组比较差异无统计学意义（均p>0.05)。结论 lps致新生大鼠的急性肺损伤存在mmp2和timp2的表达失衡，进而可能通过破坏基底膜参与急性肺损伤的病理过程。

【关键词】 急性肺损伤；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶组织抑制剂2；新生大鼠；脂多糖

expressions of mmp2 and timp2 in lipopolysaccharideinduced

acute lung injury of neonatal rats

yin jing1,yang li2( of clinical medical science,southeast university,nanjing 210009,china;ment of pediatrics,

zhongda hospital,southeast university,nanjing 210009,china)

abstract:objective to investigate the expressions of mmp2 and timp2 in neonatal rats with acute lung injury(ali) induced by lipopolysaccharide（lps）.methods thirty neonatal rats of 7days were randomly divided into saline control group（n=6） and acute lung injury group(n=24);the latter was randomly divided into one hour,two hours,four hours and six hours groups（n=6）.the ali models of neonatal rats were establised by inject pathological changes of lung tissue were expressions of mmp2 and timp2 protein and mrna in the lung tissues were detected by using immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (rtpcr).results pathological changes confirmed rat ali models induced by lps were reproducted ed with saline control group,the mmp2 protein and mrna expressions were increased after lps injection,and reached the peak at 4ile,the expression of timp2 had weak increace in 6h after lps sions mmp2 and timp2 expressions are imbalance in lpsinduced ali of neonatal may be involved in the pathological process of acute lung injury through the basement membrane damage.

key words:acute lung injury；matrix metallo proteinase2；tissue inhibitors of metallo proteinase2；neonatal rats；lipopolysaccharide

（modern medical journal,2009,37:204208）

急性肺损伤是由多种原因引起的肺部弥散性损害,以顽固性低氧血症、呼吸窘迫、肺顺应性下降和弥散性渗出为主要特征。而与成人相比，新生儿急性肺损伤起病急，进展快,同时伴有肺动脉高压和多脏器功能衰竭,病死率高。近年来研究表明，基底膜损伤是急性肺损伤过程中的重要事件。基质金属蛋白酶2(mmp2)是基质金属蛋白酶(matrix metalloporteinases,mmps)家族中成员,是降解基底膜主要成分ⅳ型胶原的重要酶系。作者通过腹腔注射脂多糖(lps)的方法复制大鼠急性肺损伤模型,观察肺组织中mmp2及其组织抑制剂(timp2)的动态变化，探讨两者在内毒素致急性肺损伤发生、发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 动物、试剂及仪器

7日龄清洁级sd新生大鼠30只（由东南大学医学院实验动物中心提供）,体重12.0～15.0g,雌雄不限。大肠杆菌lps（sigma公司，血清型0111b4），兔抗大鼠单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），ｐｃｒ试剂盒（南京建成生物公司），olympus光学显微镜（日本）。

1.2 动物分组及模型制备

30只大鼠随机分为生理盐水对照组（n=6）和急性肺损伤组（n=24）,后者进一步分为1、2、4及6h亚组，每组6只。急性肺损伤组予以5mg·kg-1 lps腹腔注射；生理盐水对照组予以5ml·kg-1生理盐水腹腔注射。

1.３ 大鼠肺组织病理学观察

1.3.1 he染色 采用朱列伟等［1］的方法对大鼠肺组织病理学改变进行评价。lps腹腔注射后1、2、4和6h观察大鼠肺组织大体病理改变,并取左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h,石蜡包埋，5μm切片,常规he染色,光镜观察大鼠肺组织病理学改变。

1.3.2 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色按标准程序操作。磷酸盐缓冲液（pbs）代替一抗作为阴性对照。染色阳性为棕黄色颗粒。每个时间点各组选取切片5张,高倍镜下每张切片随机选择5个视野,利用imaging porporation图像分析系统,应用meta morph软件测定其平均灰度值。

1.3.3 rtpcr观察肺组织中mmp2和timp2的基因表达 按trizol常规一步法提取肺组织总rna,按逆转录试剂盒中的说明书进行逆转录反应，得到cdna，在pcr仪中反应：taq酶0.5μl,pcr buffer(含镁离子)2.5μl,dntp 0.5μl,10μm的上下游引物各0.5μl，rt 产物 4μl,用双蒸水补足体系至25μl。mmp2（269bp）上游引物：5′gattgatgccgtgtac gagg3′,下游引物：5′agtctgcgatgagcttcgg3′,退火温度62℃,30个循环。timp2(309bp)上游引物：5′gcagataaagatgttcaaagg3′，下游引物：5′cagtccatccagaggcac3′,退火温度58℃,30个循环。βactin(632bp)上游引物：5′gatggtggg tatgggtcagaagga3′,下游引物：5′gctcattgc cgatagtgatgacct3′。反应结束后取pcr产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳,经凝胶成像分析系统分析电泳条带。以目的基因与内参基因条带的吸光度的比值代表其表达的相对量。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 统计学处理

所有数据采用spss 15.0统计学软件进行分析。计量资料采用x-±s表示,组间比较行方差分析及t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肺组织he染色

光镜下生理盐水对照组肺组织结构完整,肺泡腔清晰,肺泡隔无水肿、炎症等改变（图1a）；急性肺损伤组肉眼见肺组织有不同程度的出血，光镜下见肺泡腔狭窄,肺组织有明显渗出、水肿出血及大量炎性细胞浸润（图1b）。

图1 两组肺组织切片 he×400

2.2 大鼠肺组织mmp2及timp2蛋白表达

mmp2阳性表达定位于胞浆。生理盐水对照组mmp2呈弱阳性表达，呈淡棕黄色；急性肺损伤组mmp2表达增强，主要在气道上皮细胞、肺泡上皮细胞基底膜和内皮细胞，且随着lps注射时间的延长，其表达逐渐增强，6h时呈现深褐色，两组比较差异有统计学意义（p<0.05或p<0.01）。急性肺损伤组 timp2呈淡棕黄色弱阳性表达，6h内呈微弱增加趋势，与生理盐水对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）。见图2、表２。

2.3 mmp2和timp2的基因表达

pcr产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在269bp附近见mmp2 mrna阳性电泳带，mmp2 mrna在生理盐水对照组有轻微表达，lps注射1h后mmp2 mrna表达逐渐增强。lps注射1h后在309bp附近有timp2 mrna阳性电泳带,在生理盐水对照组几乎不表达，lps注射后6h内表达未见明显变化（图3）。注射lps后mmp2 mrna表达有逐渐增强趋势，注射后2～6h与生理盐水对照组比较差异有统计学意义（p<0.05或 p<0.01）,注射后 6h，mmp2 mrna表达达高峰。lps注射后timp2 mrna表达较生理盐水对照组可见微弱增加趋势，但差异无统计学意义（p>0.05）（表3）。表２ 两组大鼠肺组织mmp2和timp2蛋白表达表3 两组大鼠肺组织mmp2和timp2 mrna表达

3 讨 论

引发急性肺损伤的各种因素如环境及内源性毒素，均能触发多种效应细胞、炎症介质和细胞因子参与反应。近来发现，在急性肺损伤过程中基底膜的断裂与mmps有关［2］，尤其是mmp2被认为与急性肺损伤密切相关［34］。mmp2是一种广泛分布的明胶酶，正常上皮细胞和内皮细胞均有表达，可降解基底膜的多种成分，参与基底膜的转换［5］。mmp2的组织抑制因子timp2是它的主要内源性抑制因子。组织中mmps与timps之间保持着相对平衡状态，它们的平衡和相互影响决定着细胞外基质是降解还是聚集［6］。有学者［78］应用选择性的环氧化酶抑制剂可显著减少内毒素性肺损伤时肺组织mmp2 mrna的表达，进而能减轻肺水肿、出血和炎性细胞浸润。下调高氧诱导新生大鼠mmp2 mrna的高表达可使胶原蛋白含量增加从而减缓急性呼吸窘迫综合征病情进展，这些进一步证实了新生大鼠急性肺损伤与mmp2的过度表达有关。

革兰阴性杆菌内毒素产物lps是制备成年动物急性肺损伤模型中最常用的诱导剂。本实验通过新生大鼠腹腔注射5mg·kg-1 lps建立急性肺损伤模型，大鼠肺组织病理改变符合急性肺损伤的病理改变［9］。本实验结果显示，与生理盐水对照组比较，新生大鼠lps腹腔注射后肺组织中mmp2蛋白表达增强，且随lps作用时间延长而逐渐增强，4～6h达高峰，差异有统计学意义（p<0.05），该结果与mmp2 mrna的表达结果一致。lps注射后timp2蛋白及mrna仅弱阳性表达，6h内有微弱增加趋势，但差异无统计学意义（p>0.05）。组织中mmp2活性的升高与急性肺损伤发生的时间及程度一致,这提示新生大鼠急性肺损伤可能与mmp2的过度表达有关。由于mmp2表达增加的幅度较timp2大，导致mmps与tipms比例失调，相对增多的mmp2失去了内源性的抑制，从而加强了对基底膜的降解，造成其严重受损，促进了炎症反应，进而导致了急性肺损伤的发生。然而lps作用后导致mmp2表达增加的作用靶点及其具体分子机制尚有待深入研究。

lps致新生大鼠急性肺损伤与新生儿肺出血的病理机制相似，这提示如能使用人工合成的mmps抑制剂(mmpi)，在新生儿肺出血发病早期及时采取积极措施，干预mmps的表达，从而使mmps/tipms比例协调，发挥正常生理作用，将为新生儿肺出血早期防治提供新的思路。近年来，人工合成的mmpi已有10多种，已应用于成人肿瘤及关节炎方面治疗，但在新生儿领域尚存在使用剂量不明确、生物利用率低及不良反应等问题，故临床上如何确切判断mmps和tipms在新生儿肺出血中的表达及作用，进而合理的使用mmpi值得进一步探讨。

【参考文献】
［1］朱列伟,施炳培,金勤立,等.氦氖激光在预防肺出血中的对肺表面活性物质的影响[j].中华物理医学杂志,1998,20（4）:214216.

［2］ohbayashi metalloporteinases in lung diseases[j].curr portein pept sci,2002,3(4):409421.

［3］张金秋,李银平,黎檀实.肺泡上皮细胞功能特性与内毒素性急性肺损伤［j］.中国危重病急救医学,2005,17:382384.

［4］suga m,iyonaga k,okamoto t,et teristic elevation of matrix metall oproteinase activity in idiopathic interstitial pneumonias［j］.am j respir crit care med,2000,162(5):19491956.

［5］foda h d,rollo e e,drews m,et atorinduced lung injury upergulates and activates gelatinases and emmprin attenuation by the synthetic matrix metalloporteinase inhibitor,prinomastat(ag3340)[j].am j respir cell mol biol,2001,25(6):717724.

［6］lanchou j,corbel m,tanguy m,et nce between matrix metalloporteinases(mmp9 and mmp2) and tissue inhibitors of metalloprteinass(timp1 and timp2) in acute respiratory distress syndrome patients[j].grit caer med,2003,31(2):536542.

［7］翁翠莲,汪建新,李新甫,等.mmp2 mrna在内毒素致兔急性肺损伤中的作用及美洛昔康的影响［j］.解放军医学杂志,2006,31(11):10561059.

［8］李文斌,常立文,祝华平,等.维甲酸下调高氧暴露下胎鼠肺成纤维细胞及ⅱ型肺泡上皮细胞mmp2表达［j］.基础医学与临床,2005,25(2):141145.

［9］anderson w r,thielen ative study of adult respiratory distress syndrome by light,scanning and transmission electron microscopy[j].ultrastruct pathol,1992,16(6):615628.