人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长的抑制作用

【摘要】 目的探讨野生型人剪切修复基因着色性干皮病基因d(xeroderma pigmentosum d,xpd)对肝癌细胞smmc7721增殖的影响，并探讨其机制。方法用脂质体转染法瞬时转染smmc7721细胞，转染重组质粒xpdn2和空载质粒n2，并用未转染的与xpdn2、n2具有相同遗传背景和代数的smmc7721细胞作为空白对照。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况，流式细胞仪检测细胞周期，逆转录聚合酶链反应（rtpcr）、western blot法检测细胞中xpd、cmyc、cdc25a、cdk2表达量变化，mtt法观察细胞增殖的活力。结果提取出的重组质粒pegfpn2xpd用酶切鉴定，与genebank上的相符。在荧光显微镜下，可以在smmc7721pegfpn2、smmc7721pegfpn2xpd细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达，质粒的转染效率为30%左右。流式细胞仪结果显示，pegfpn2xpd重组质粒转染入细胞后，肝癌细胞进入s期发生阻滞，停滞在g1期。rtpcr、western blot检测发现smmc7721pegfpn2xpd细胞与smmc7721pegfpn2和smmc7721两对照组相比，其xpd 表达明

显增高（p<0.05）。cmyc、cdc25a、cdk2相对表达量明显减少，差异有统计学意义（p<0.05）。与两对照组相比，smmc7721pegfpn2xpd细胞增殖率明显减弱（p<0.05）。WWw.lw881.com结论野生型xpd基因可以在转录和翻译水平抑制smmc7721细胞内cmyc、cdc25a、cdk2的表达。而且野生型xpd基因通过抑制cdk2的表达作用于s期dna损伤检控点，从而抑制smmc7721细胞增殖。

【关键词】 肝癌； xpd；cmyc；cdc25a；cdk2；dna损伤检控点

xeroderma pigmentosum d gene inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line smmc7721

huang shenan1, xu jiangjing2, zhang jixiang1,2, xiong ying1, yin dong2, li jun1

1．department of gastroenterology, the second affiliated hospital of nanchang university, nanchang, jiangxi 330006, china；2．jiangxi provincial key laboratory of molecular medicine

corresponding author:zhang jixiang,email: jixiangz@tract：objective the xeroderma pigmentosum d (xpd) gene plays an important role in the path to dna repair. it has been reported that cells obtained high tumor susceptibility when mutation happened in xpd gene. the purpose of this study is to investigate the influence of xpd gene in the growth and proliferation of hepatoma carcinoma cells (hcc).methodspegfpn2 and pegfpn2xpd were transfected into smmc7721 cell lines by lipofectamine2000 method. the expression of green fluorescent protein (gfp) was observed through fluorescence microscope. cell cycle of the plasmidtransfected smmc7721 cells was analyzed by flow cytometry (fcm). the expressions of wildtype xpd, cmyc, cdc25a and cdk2 were detected by rtpcr and western blot. cell proliferation was measured by mtt sthe recombinant plasmid pegfpn2xpd was successfully transfected into smmc7721 cells and green fluorescence in cells was observed by fluorescent microscopy. around 30% transfection efficiency was obtained in this experiment. in addition, we have found that wild type xpd blocked the hepatoma cells from s stage to g1 stage the expression of xpd in smmc7721pegfpn2xpd cells was significantly higher than those in control group of smmc7721 and smmc7721pegfpn2 cells (p<0.05). the expressions of cmyc, cdc25a and cdk2 in smmc7721pegfn2xpd cells were significantly lower than those in control cells (all p<0.05). furthermore, smmc7721pegfpn2xpd has reduced proliferation ability than empty plasmidtransfected cells (p<0.05).conclusionwildtype xpd downregulated the expression of cmyc, cdc25a, and cdk2. our results suggested that xpd inhibit the proliferation of smmc7721 cells probably due to the blockage at s period dna damage checkpoint in hepatocellular carcinoma cell cycle.

key words：liver cancer; xpd; cmyc; cdc25a; cdk2; dna damage checkpoint

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株和质粒来源人肝癌细胞smmc7721购自中国典型培养物保藏中心(cctcc)。重组质粒pegfpn2xpd本实验室构建。

1.1.2主要试剂和产地rpmi1640购自美国gibco brl公司。胎牛血清（fbs）购自南非hyclone公司。trypsin、monoclonal antibody against βactin购自美国sigma公司。lipofectamine2000tm、trizoltm试剂购自美国invetrogen公司。wazard purefection plasmid dna pufiication system、mmlv reverse transcriptase、rnasin、dntp、oligo(dt)15购自美国promega公司。dmso、depc购自美国amresco公司。pcr引物购自上海生物工程技术服务有限公司。taq酶购自日本takara公司。dna 2000 ladder marker购自北京华美生物工程公司。mtt购自上海普飞生物技术有限公司。单克隆抗体xpd、cmyc、cdc25a和cdk2购自美国santa cruz公司。山羊抗鼠igg辣根过氧化物酶、山羊抗兔igg辣根过氧化物酶购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养smmc7721细胞在含15% fbs的rpmi1640培养基中，37℃、5%co2的条件下孵箱（forma scientific inc,usa）中培养，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3天传代一次。

1.2.2质粒鉴定用碱裂解法提取空载质粒pegfpn2和重组质粒pegfpn2xpd，提取出的质粒以kpnⅰ、bgiⅱ和sphⅰ酶切鉴定。

1.2.3质粒转染实验设3组，每组2孔，分别为无转染空白对照组（smmc7721），空载质粒转染细胞组（smmc7721pegfpn2）以及重组质粒转染细胞组(smmc7721pegfpn2xpd)。以2×105个细胞/孔的密度将smmc7721细胞铺于6孔板内，24h细胞铺90%，pegfpn2、pegfpn2xpd每孔0.4μg，脂质体每孔10μl介导转染。转染6h后换有血清的培养基在37℃、5%co2的条件下孵育。40h后在荧光显微镜下观察，荧光显微镜激发光波长395nm，观察pegfp释放波长为508nm的绿色荧光。

1.2.4流式细胞仪（重复3次）用胰酶消化收集上述各组转染后的细胞，应用facscalibar流式细胞仪（beckton dickinson公司，usa）分析，氩离子激光器激发波长为488nm，在流式细胞仪上进行细胞周期分析，得出细胞各周期的百分率。

1.2.5rtpcr测定基因表达量使用trizol试剂提取各组细胞总rna，按照superstcripttm试剂盒说明合成cdna。使用核酸蛋白分析仪（eppendof公司,german）测定总rna以及cdna浓度。根据genbank中公布的人类xpd mrna序列，人类cmyc mrna序列、人类cdc25a mrna序列，人类cdk2 mrna序列，以及人类βactin mrna序列设计引物。xpd正义：5′gcccgctctggattatacg3′，反义：5′ctatcatctcctggccccc3′，扩增片段长度436bp；cmyc正义：5′aacccttgccgcatccac3′，反义：5′cctcctcgtcgcagtagaaa3′，扩增片段长度317bp；cdc25a正义：5′ tgatgaggatgatggcttcg3′，反义：5′ctgcacccttgatgtggc3′，扩增片段长度562bp；cdk2正义：5′actggcattcctcttccc3′，反义：5′ctggcttggtcacatcctg 3′，扩增片段长度589bp；βactin正义：5′cttcctgggcatggagtc3′，反义：5′gccgatccacacggagta3′，扩增片段长度232bp。6μl pcr扩增产物经1.5%琼脂糖（含溴乙锭5μg/ml）电泳，通过fr200图像分析软件（上海复日公司）读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组βactin条带的扫描值标化其相应组的xpd、cmyc、cdc25a、cdk2条带的密度扫描值，获得其相对表达量，并进行统计学分析。

1.2.6mtt法（重复4次）在96孔板中进行3组细胞的转染，每组6孔，每孔1×103个细胞，对照组只加培养基，转染后培养40h，每孔加入5mg/ml mtt 10μl，继续培养4h，弃上清，加入100μl dmso，振荡10min，酶标仪（labststems,芬兰）测定492nm处各孔吸光度（a）值，取每孔平均值。计算细胞抑制率，细胞抑制率=(1-a实验组／a对照组)×100%。

1.2.7蛋白表达检测（western blot）使用蛋白抽提液分别提取三组细胞的总蛋白，使用全自动生化分析仪（beckman,usa）测定蛋白浓度。取同量蛋白上样于8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，继而转移蛋白于硝酸纤维素膜；将膜置于含5%脱脂奶粉的tbst中4℃封闭过夜，加封闭液稀释的一抗(1∶200)过夜，用tbst洗膜3×15min，加封闭液稀释hrp标记二抗（1∶2000），4℃过夜，tbst洗膜3×30min，显色。

1.3统计学方法 数据以±s表示，方差齐使用卡方检验，方差不齐使用秩和检验，并应用spss11.5统计软件进行分析。

2结果

2.1pegfpn2xpd质粒鉴定重组质粒经kpnⅰ和bgiⅱ双酶切后电泳应在4737bp位置和约2300bp位置各有一条带。此外，限制性核酸内切酶sphⅰ在pegfpn2纯质粒的2332、2404、3167bp位置和xpd的636bp位置各有一酶切位点，同时我们的xpd是在pegfpn2质粒的612bp和652bp之间以正义方向插入，所以重组质粒经sphⅰ单酶切后电泳应包括2818、3344、763和72bp四条带。与genebank中公布的人类xpd完整mrna序列nm_000400.2相符合,见图1。

　　2.2pegfpn2xpd转染成功鉴定pegfpn2载体在其多克隆位点后带有绿色荧光蛋白报告基因。通过脂质体转染方式将pegfpn2和pegfpn2xpd重组质粒转染入smmc7721细胞40h后，在荧光显微镜下观察到了细胞中绿色荧光蛋白的表达，见图2。未转染质粒的纯smmc7721细胞则没有。通过激光共聚焦显微镜观察pegfpn2xpd的转染效率，转染后40h，转染效率为30%左右。

2.3pegfpn2xpd重组质粒对smmc7721细胞周期的影响smmc7721pegfpn2xpd重组质粒转染细胞组与两对照组相比g1期细胞明显增多，s期细胞明显减少，差异均有统计学意义（p<0.05）。smmc7721pegfpn2空质粒转染细胞组与smmc7721细胞组g1、s期差异无统计学意义,见表1。因此smmc7721pegfpn2xpd重组质粒转染细胞进入s期出现障碍，停滞在g1期的细胞增多。表1流式细胞仪分析各组细胞细胞周期情况

　　2.4三组细胞内xpd、cmyc、cdc25a、cdk2 mrnas的表达情况

　　2.5三组细胞内xpd、cmyc、cdc25a、cdk2蛋白的表达情况转染野生型xpd后，smmc7721细胞内xpd表达明显增高,cmyc、cdc25a、cdk2表达明显下降（p<0.05），而空白对照组以及空质粒转染组之间差异无统计学意义（p>0.05），见图4。

　　2.6pegfpn2xpd重组质粒对smmc7721细胞增殖活力的影响重组质粒转染组smmc7721xpd细胞增殖有了明显变化，与空质粒n2转染组细胞smmc7721pegfpn2和空白对照组细胞smmc7721相比，smmc7721xpd细胞增殖明显减少。smmc7721pegfpn2xpd细胞组相对于smmc7721细胞组抑制率为50%（p<0.05）；smmc7721pegfpn2细胞组相对于smmc7721细胞组抑制率为5%（p=0.45）。这说明xpd基因降低了smmc7721细胞代谢，抑制了smmc7721细胞的增殖。

3讨论

　　近年来的研究发现，哺乳动物基本转录因子ⅱh (tfⅱh)特别是xpd参与了核酸切除修复（ner）。研究者指出，xpd基因发生突变时，肿瘤易感性更高[2]。我们把野生型xpd基因转染入肝癌细胞中，发现肝癌细胞中的cmyc、cdc25a、cdk2基因在转录和翻译水平表达量明显减少；细胞周期停滞在g1期，不能进入s期；肝癌细胞增殖明显受到抑制。肝癌中cmyc表达常过量，本实验组已证实野生型的tfⅱh之一xpb可以抑制cmyc表达[3]。xpd可以通过fuse结合蛋白（fbp）影响cmyc的表达；fbp有潜在的转录活化和抑制功能，是cmyc表达所必需的；fbp干扰抑制子（fir）可通过tfⅱh阻断转录，而fbp可结合cmyc基因的单链上游活化元件（fuse）来抑制cmyc表达[4]。当xpd发生突变时，突变型xpd可以阻断fuse结合蛋白（fbp）的活化，而后者的活化可以使cmyc表达下降，当xpd发生缺陷或突变时cmyc表达量常增加；将fbp或/与xpd转入进xpd缺陷的细胞后cmyc表达量可下降[5]。cdc25a在多种肿瘤中如结肠癌、乳腺癌、肝癌[6]等均有过度表达，并且与患者预后有关，cdc25a被认为是一种癌基因，分别在g1/s期和g1期中发挥作用。cdc25a过度表达可导致细胞生长失控后恶化。cdc25a是cmyc的靶基因之一[7]。本实验在smmc7721细胞中转染xpd后，细胞中癌基因 cmyc、cdc25a表达量均下降，野生型xpd抑制了cmyc、cdc25a基因的表达。癌基因表达下降，可引起癌细胞的生长力降低。cdk2是s期的关键性激酶，在进入s期和dna复制过程中发挥其引擎作用[8]。在dna复制过程中如果遇到dna损伤，被激活的chk1磷酸化cdc25a，cdc25a能够去除cdk2上的抑制性磷酸根。这样抑制了cdc25a最终抑制了cdk2的活性，从而抑制了尚未起始的dna复制起始点的发动。cdc25a、cdk2基因都是与细胞周期密切相关的基因。在细胞周期进程中，g1期是个重要的调控点，它决定细胞是否通过g1期，进入s期，从而进行细胞增殖，因此g1/s转换的调控机制成为肿瘤研究的热点，细胞周期g1期和g1/s转换期各调节因子的异常改变与细胞癌变关系尤为密切[9]。我们的流式细胞仪分析结果指出：xpd基因转入肝癌细胞后，细胞停滞在g1期，进入s期发生障碍。表明xpd基因可以使癌细胞停滞在g1期，从而使癌细胞增殖大幅度减少，mtt结果也证实了这一结论。肿瘤的发生与机体dna修复能力有关。细胞在长期进化过程中发展了一套能够检测dna损伤、维护细胞遗传稳定性和完整性的机制，这个机制被称为dna损伤检控点（dna damage checkpoint）。cdc25a基因是dna损伤检控点信号转导途径中的效应器。在细胞损伤修复过程中，atm、atr和chk1、chk2通过限制cdc25a的活性和浓度，将dna复制所需的cdk2活性保持在一个较低的水平，从而限制着dna复制进行的速度，防止肿瘤的形成和基因突变。本实验研究结果指出xpd基因有可能也通过了类似的途径来抑制肝癌细胞的生长。本实验对xpd基因抑制肝癌细胞生长的机制作了探讨，可能的机制：(1)xpd基因抑制癌基因cmyc、cdc25a基因的表达，从而抑制肝癌的增殖；(2)xpd基因抑制cdk2基因的活性，从而抑制了尚未起始的dna复制起始点的发动，肝癌细胞周期停滞在g1期，使细胞进入s期发生障碍，细胞复制显著减少；(3)已有研究指出xpd基因可以激活p53[10]，①p53是抑癌基因，本实验组已证实它可以抑制肝癌细胞的生长[3]；②p53是dna损伤检控点中最关键的激活因子[11]，xpd基因通过激活p53，进一步激活dna损伤检控点；（4）过去的研究表明：xpd基因发生突变时，dna损伤检控点受到破坏[12]。野生型xpd基因可以激活dna损伤检控点，我们的实验指出xpd基因抑制了cdc25a的表达，肝癌细胞中cdc25a的表达量下调，从而使cdk2的表达更加减少，激活了s期dna损伤检控点，xpd基因通过dna损伤检控点，防止肿瘤的形成和基因突变。我们的实验为以后xpd基因抑制其他癌细胞生长提供了理论基础，为肝癌及其他恶性实体瘤的综合治疗提供了实验依据。但是xpd基因抑制肝癌生长的具体机制不是很清楚，还需要进一步的研究。

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