肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对佐剂性关节

肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中tnfα、hif1α和vegf表达的影响

【关键词】 佐剂性关节炎;大鼠;可溶性重组人肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白;肿瘤坏死因子α;缺氧诱导因子1α;血管内皮生长因子

【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(益赛普)对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏死因子α(tnfα)、缺氧诱导因子1α(hif1α)、血管内皮生长因子(vegf)表达的影响。方法 将成年雄性wistar大鼠随机分为5组，ⅱ～ⅴ组建立佐剂性关节炎大鼠(aa)模型，于造模后第12天开始ⅲ组给予甲氨喋呤灌胃治疗，ⅳ～ⅴ组给予益赛普皮下注射治疗。第28天取膝关节滑膜，常规he染色，计算滑膜病理积分，免疫组织化学染色检测tnfα、hif1α和vegf在膝关节滑膜的表达。结果 ⅰ组大鼠滑膜组织均有少量tnfα、hif1α和vegf的表达，ⅱ～ⅴ组较ⅰ组均明显增高。ⅳ、ⅴ组滑膜组织tnfα表达较ⅱ组明显减低(p<0.01)而ⅲ组与ⅱ组差异无统计学意义。ⅲ～ⅴ组滑膜组织hif1α、vegf的表达均明显低于ⅱ组，差异有统计学意义(p<0.01)。结论 益赛普可明显降低aa大鼠滑膜组织tnfα、hif1α和vegf表达。益赛普可以降低aa大鼠的关节炎指数、足体积，减轻足肿胀程度，对aa大鼠的关节炎症有明显的治疗作用。

【关键词】 佐剂性关节炎;大鼠;可溶性重组人肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白;肿瘤坏死因子α;缺氧诱导因子1α;血管内皮生长因子

　the effect of rhutnfrfc on the levels of tnfα,hif1α and vegf in synovium of adjuvant arthritis in rats xu yudong*,jin hongtao*,song xinmei,et al.*department of rheumatology,the second hospital of hebei medical university,shijiazhuang 050000,china

　　【abstract】 objective to investigate the changes of levels of tnfα,hif1α and vegf in in synovium of adjuvant arthritis (aa) in rats after injection with rhutnfrfc (etanercept).methods the adult male wistar rats were randomly divided into 5 groups:the aa model was induced with freund complete adjuvant,on the 12th day after induction,the rats in group ⅲ were given with mtx (2.7 mg/kg) by intragastric administration;the rats in group ⅳ,ⅴwere given with etanercept by subcutaneous arthral pathological score was calculated,the levels of tnfα,hif1α and vegf were detected by histoimmunochemical staining at different stages after cfa s the tnfα,hif1α and vegf levels in experimental group were higher than that in control levels of tnfα in group ⅳ,ⅴ were significantly lower than those in group ⅱ,however,there was no significant difference between group ⅲ and group ⅱ.the levels of hif1α and vegf in group ⅲ,ⅳ,ⅴwere significantly lower than those in group ⅱ(p<0.05). conclusion etanercept is able to reduce significantly the levels of tnfα,hif1α and vegf in synovium tissue of rats with aa,and which is able to decrease arthritis indexes and foot volume,as a result,which is effective in treating adjuvant arthritis of rats.

　　【key words】 adjuvant arthritis rat;rhutnfrfc;tumor necrosis factorα;hypoxiainducible factor1α;vascular endothelial growth factor

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎，对称性和破坏性关节病变为主要特征[1]。血管新生促进滑膜血管翳的发生和发展，维持血管翳的侵袭性，促进软骨和骨破坏及关节重构，最终造成关节畸形、强直和功能丧失。缺氧诱导因子1(hif1)、血管内皮生长因子(vegf)是促进血管新生的关键因子，可能在ra发病机制中起重要作用。在细胞因子相互作用的网络中肿瘤坏死因子α(tnfα)居于中心位置，是ra滑膜炎发生和持续的一个关键性因子[2]。本试验以佐剂诱导的关节炎大鼠模型为基础，观察肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(益赛普)对关节炎的影响，评价其疗效，探讨益赛普治疗ra的机制、临床应用价值及其对滑膜组织血管增生的抑制情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂 wistar大鼠90只，雄性，体重140～160 g，由河北省实验动物中心提供，合格证号 802120，许可证号scxk(冀) 20031003。

　　完全弗氏佐剂(fca，10 ml)购于sigma公司，卡介苗(bcg，50 mg/支) 购自华瑞创新生物科技开发中心。tnfα免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物制品公司，vegf免疫组化成套试剂盒购自晶美生物制品公司。

　　1.2 分组及aa大鼠模型的建立 将90只雄性wistar大鼠采用数字表法随机分为5组，分别编号ⅰ～ⅴ组，ⅰ组10只，ⅱ～ⅴ组每组20只。ⅰ组为正常对照组，ⅱ组为单纯造模组，ⅲ组为造模+甲氨喋呤组，ⅳ组为造模+益赛普低剂量组(0.44 mg/kg)，ⅴ组为造模+益赛普高剂量组(0.88 mg/kg)。将fca与卡介苗配置为含bcg 10 mg/ml 的水包油乳剂。试验第1天在ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ组大鼠的尾根部皮内注射该乳剂0.2 ml致炎，诱发佐剂性关节炎。而ⅰ组大鼠的尾根部皮内注射等量0.9%氯化钠溶液。

　　1.3 给药 于致炎后第12～23天ⅳ、ⅴ组皮下注射益赛普，ⅳ组予以益赛普0.44 mg·kg-1·d-1，ⅴ组予以益赛普0.88 mg·kg-1·d-1。给药容积均为0.1 ml/100 g，连续12 d。ⅲ组大鼠给予甲氨喋呤2.7 mg/kg灌胃，ⅱ组大鼠给予蒸馏水灌胃0.5 ml·只-1·d-1;给药时间均固定在每天上午9∶00。

　　1.4 测量足体积及关节炎指数(ai)的评定 于实验的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27天用排水法测右足体积，分别测量3次，取平均值。根据关节红肿程度进行ai的评定，标准[3]如下：0分：无关节炎;1分：个别足趾发红、肿胀;2分：大部分足趾及足底肿胀;3分：踝关节以下肿胀;4分:肿胀累及踝关节以上，不能负重;ai=四肢关节评分之和。

　　1.5 病理学及免疫组织化学检测 于致炎后第28天，处死所有大鼠并取膝关节滑膜组织，置于4%多聚甲醛固定液中固定，以备作病理及免疫组织化学检测。常规he染色并计算滑膜病理积分，按照程度不同分别评分[4]：0分：正常;1 分：极少炎性细胞浸润或(和)组织轻微水肿;2分：轻微浸润;3分：中等浸润;4分：明显浸润;5分：严重浸润。免疫组化检测用sabc (链霉亲和素生物素酶复合物)法，tnfα、hif1α和vegf阳性滑膜细胞均呈颗粒状棕黄色或棕褐色。采用真彩色图像分析系统对tnfα、hif1α和vegf表达强度进行定量分析。方法[5]如下：每张切片随机选取5个视野(×200)，系统自动测量出阳性染色部位的积分光密度(iod)，5个视野的平均iod值代表该切片tnfα、hif1α和vegf的表达情况。

　　1.6 统计学分析 应用spss 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，相关性采用直线相关分析，p<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 ⅱ～ⅴ组大鼠造模后共有38只于第15～19天先后出现关节红、肿等关节炎表现，给药期间ⅱ组死亡1只，ⅲ、ⅳ组各有1只受伤，剔出死亡、受伤及造模不成功的大鼠后，最终入选实验统计结果的实验动物共计45只，ⅰ、ⅱ组各10只，ⅲ、ⅳ组各9只，ⅴ组7只。

　　2.2 ai值及足体积的测定 ⅰ组大鼠无足爪肿胀，各时间点ai值均为0分，ⅱ～ⅴ组大鼠ai值均高于ⅰ组，差异有统计学意义(p<0.05)。造模后第21～27天ⅴ组大鼠的ai值明显低于ⅱ组，差异有统计学意义(p<0.05)，而ⅲ、ⅳ组ai值虽然均低于ⅱ组但差异无统计学意义(p>0.05)。ⅲ、ⅳ、ⅴ组两两之间在各时间点ai值差异无统计学意义(p>0.05)。见表1。表1 4组大鼠在不同时间段ai值比较

　　2.3 各组不同时间段右足体积比较 试验前5组大鼠之间右足体积差异无统计学意义(p>0.05)。ⅱ～ⅴ组大鼠右足体积于造模后第15天开始明显增高，与ⅰ组比较，ⅱ组于造模后第15天足肿胀程度明显增高(p<0.05或<0.01);ⅲ～ⅴ组于造模后第18天足爪肿胀程度明显增高(p<0.05)，并于第21～24天逐渐达肿胀高峰，除ⅳ组外，ⅲ、ⅴ组于第27天足肿胀程度均略好转，但与ⅰ组比较差异仍有统计学意义(p<0.05)。与ⅱ组比较，ⅲ组虽然足肿胀程度低但差异无统计学意义(p>0.05)，ⅳ组于第21～24天足体积明显低于ⅱ组(p<0.05)，但第27天与差异无统计学意义(p>0.05);ⅴ组于第21～27天足体积均明显低于ⅱ组(p<0.05)。ⅴ组于给药12 d后足体积明显低于ⅲ组(p<0.05);ⅲ组与ⅳ组、ⅳ组与ⅴ组差异均无统计学意义(p>0.05)。见表2。表2 5组大鼠不同时间段右足体积比较

　　2.4 大鼠滑膜病理学改变及病理学评分 ⅰ组正常大鼠滑膜衬里层有1～2层滑膜细胞组成，且部分不连续。滑膜衬里层下层为由脂肪细胞、少量成纤维细胞、巨噬细胞和少量血管组成的结缔组织。滑膜组织无炎性细胞浸润，无纤维组织增生。ⅱ组可见滑膜组织中等量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润，平均病理积分3.8±0.4，滑膜衬里层增生达4～6层。ⅲ～ⅴ组滑膜组织病理积分均明显低于ⅱ组，差异有统计学差异(p<0.01);ⅴ组滑膜组织病理积分低于ⅲ组(p<0.05);ⅳ组滑膜组织病理积分与ⅲ、ⅴ组之间差异无统计学意义(p>0.05)。见表3。表3 大鼠膝关节滑膜病理学积分

　　2.5 滑膜组织tnfα、hif1α和vegf的表达 ⅰ组大鼠滑膜组织有少量tnfα、hif1α和vegf的表达。与ⅰ组比较,ⅱ～ⅴ组均明显增高(p<0.01)。与ⅱ组比较，ⅳ、ⅴ组滑膜组织tnfα表达明显减低，差异有统计学意义(p<0.01);ⅲ组tnfα表达虽低于ⅱ组，但差异无统计学意义(p>0.05);ⅲ～ⅴ组滑膜组织hif1α、vegf的表达均明显低于ⅱ组(p<0.01)。ⅳ、ⅴ组滑膜组织tnfα表达低于ⅲ组(p<0.05)，ⅴ组滑膜组织tnfα表达低于ⅳ组(p<0.05)。ⅲ、ⅳ组滑膜组织hif1α、vegf的表达均高于ⅴ组(p<0.05);ⅲ与ⅳ组之间差异无统计学意义(p>0.05)。见表4、图1～8。表4 5组大鼠膝关节滑膜组织tnfα、hif1α和vegf iod值比较注：与ⅰ组比较，*p<0.01;与ⅱ组比较,#p<0.01;与ⅲ组比较，△p<0.05，与ⅳ组比较，☆p<0.05

　　2.6 滑膜病理学评分与tnfα、hif1α和vegf表达的相关性 滑膜组织tnfα、hif1α和vegf的iod值分别与病理积分成直线正相关(r=0.872，p<0.01;r=0.810，p<0.01;r=0.778，p<0.01)。

　　3 讨论

　　益赛即注射用重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白，是一种可抑制tnfα功能的生物制剂。目前益赛普抗炎疗效的可能的机制包括：(1)减少炎症部位的细胞生成;(2)下调滑膜细胞因子的表达;(3)降低血浆mmp1和mmp3的水平;(4)可调节细胞的凋亡[6]。有研究结果显示，应用益赛普治疗的ra患者关节炎症明显好转。hif1α和vegf在血管新生的病理和生理中炎症具有重要作用。hif1α是缺氧状态下血管生成的核心调控因子，可上调vegf表达。研究显示，在体内tnfα启动vegf生成以促进血管新生，抗tnfα治疗可降低vegf生成及与ra相关的血管新生，使增生血管复原[7，8]。抗tnfα制剂，在体外培养的滑膜细胞可抑制vegf生成[9]。本实验显示，益赛普可抑制滑膜组织tnfα、hif1α和vegf的过度表达，且和足体积、关节炎指数均呈直线正相关。益赛普治疗组滑膜组织tnfα的表达低于单纯造模组，而甲氨喋呤组与单纯造模组差异无统计学意义，说明益赛普可降低滑膜组织tnfα的表达。益赛普治疗组滑膜组织hif1α、vegf的表达

　　均明显低于单纯造模组，高剂量组明显低于甲氨喋呤组，而低剂量组与甲氨喋呤组无统计学差异。说明益赛普可以降低aa大鼠滑膜组织hif1α、vegf的表达，抑制新生血管形成，从而减少血管翳的形成。益赛普治疗组大鼠滑膜组织病理积分均明显低于单纯造模组;高剂量组明显低于甲氨喋呤组，而低剂量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义。说明益赛普可以有效抑制或延缓aa大鼠关节病理改变，减轻关节病变程度且成剂量依赖性。与甲氨喋呤治疗组比较，益赛普高剂量组在足体积、ai、tnfα、hif1α和vegf在滑膜的表达、滑膜病理积分均明显降低，而低剂量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义(p<0.05)，说明益赛普起效早于甲氨喋呤，近期效果优于甲氨喋呤，这可能与给药方法不同，以及甲氨喋呤起效缓慢有关，但远期疗效尚有待观察。

　　本实验说明：经益赛普治疗的aa大鼠，从足肿胀程度、滑膜tnfα、hif1α和vegf水平、滑膜病理积分几方面均显著低于未经治疗的aa大鼠，近期疗效优于甲氨喋呤，其机制可能与益赛普中和tnfα，抑制了tnfα促炎因子的作用，从而间接抑制了对血管翳形成直接造成软骨和骨破坏起主要作用的hif1α、vegf的表达有关。

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