原花青素对过氧化氢损伤血管内皮细胞的发展分

　【摘要】 目的:探讨原花青素对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用。方法:体外培养内皮细胞,将细胞分为6组,即空白对照组(Control 组)、氧化损伤组(H2O2组)、氧化损伤加入VitC对照组(VC+H2O2组)、氧化损伤加入原花青素5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L浓度组(procyanidin-L+H2O2组、procyanidin-M+H2O2组、procyanidin-H+H2O2组)。将750 μmol/L H2O2作用于加入VitC及不同浓度原花青素预培养24 h的内皮细胞,继续培养18 h,以细胞毒四唑盐(MTT)比色试验、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)作为检测指标。结果:原花青素呈剂量依赖性降低H2O2对内皮细胞的生长抑制率,降低MDA、LDH量,增加培养液中NO2-/NO3-含量 ,各指标比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:原花青素可保护和修复过氧化氢诱导的血管内皮细胞的损伤,其作用可能与抗氧化、促进NO释放有关。
　　【关键词】 原花青素; H2O2; 内皮细胞; 氧化损伤; 动脉粥样硬化
　　细胞凋亡是由基因调控的一种细胞自主有序的死亡方式。细胞数量的稳定取决于细胞凋亡与增殖的动态平衡[1]。目前多项研究证实在动脉粥样硬化等心血管疾病发生发展过程的早期,内皮细胞凋亡有其重要的作用[2]。内皮细胞(EC)凋亡的主要诱导因素就是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的作用[3-5]。而针对这一诱导因素,抗氧化治疗对内皮细胞的凋亡具有保护作用[6-7],因而寻找和开发可以减轻氧化应激对内皮细胞的损害,抑制EC凋亡或死亡的药物对于临床应用有着重要意义。
　　原花青素(proanthocyanidin或procyanidin,PC)是在植物中广泛存在的具有抗氧化作用的多酚化合物的总称,属于生物类黄酮大家族中的一员,具有清除氧自由基、防止细胞老化、抗肿瘤、对抗血小板活化因子、改善微循环、调节免疫等多种作用。原花青素能否保护氧化损伤HUVEC,国内外相关相关报道不多。本实验研究采用体外培养VEC的方法,采用过氧化氢导致其氧化损伤的模型,研究原花青素对HUVEC损伤过程中过氧化脂质、一氧化氮的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要材料 原花青素(procyanidin)(南京替斯艾么中药研究所)溶于DMSO(上海生物工程有限公司)后避光保存,1640培养基、胰蛋白酶(杭州科易生物有限公司),VitC(湖北天圣康迪制药有限公司),四氮唑兰 (MTT) (AMRESCO公司),胎牛血清(Hyclone公司),MDA、NO、LDH试剂盒(南京建成生物工程公司),H2O2(30%,AR级,国药集团化学试剂有限公司),临用时稀释,并在5 min内使用。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 细胞培养 HUVEC株系(浙江省中医院中医基础中心实验室馈赠),培养于含10%胎牛血清培养液中,青霉素(Pennicillin)(100 kU/L)和链霉素(streptomycin) (100kU/L),置于37 ℃,5%CO2培养箱中,单层融合达到80%~90%时用0.25%胰酶消化、传代培养,用于以下实验。
　　1.2.2 细胞分组及处理 待细胞长至60%~70%融合,进行以下分组及实验:空白对照组(Control组)、H2O2损伤组、H2O2损伤加入VitC对照组(VC+H2O2组)、H2O2损伤加入原花青素5 μmol/L、25 μmol/L、50μmol/L浓度组(procyanidin-L+H2O2组、procyanidin-M+H2O2组、procyanidin-H+H2O2组)。H2O2损伤组加入750 μmol/L H2O2刺激18 h,给药组在H2O2刺激前,细胞予VitC500 μmol/L及5μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 的原花青素预培养24 h。所有的实验至少重复3次。
　　1.2.3 细胞MTT测定 细胞接种于96孔板,同前分组及处理。取各组细胞,每组加入20 μl MTT(5 mg/ml)后,5%CO2,37 ℃孵箱中继续孵育4 h,吸去每孔中培养液后加入DMSO 150 μl,放置摇床上低速振荡10 min,待结晶物充分溶解后在酶标仪上490 nm处测定每孔细胞OD值。
　　1.2.4 LDH、NO、MDA量的测定 细胞接种于24孔板,同前分组及处理,均按照试剂盒所述方法稍作改变,在多功能全波长酶标仪下测定各组OD值,通过公式计算分别求出被测样品中的 LDH、NO、MDA含量。
　　1.3 统计学处理 本研究数据采用SPSS 11.5软件进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,并采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 PC对H2O2损伤HUVEC活性的影响 H2O2与HUVEC共同孵育后,细胞活性明显降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),而给予VitC、PC后,均对H2O2损伤引起的活性降低有明显的抑制作用(P<0.01),并呈浓度依赖性(表1),浓度越高,抑制作用越强。
　　2.2 PC对LDH释放情况的影响 H2O2与HUVEC共同孵育后,LDH活性显著增加,而予VitC、PC孵育后,降低了LDH的活性水平,与损伤组比较差异有统计学意义(P<0.01),见表2。
　　2.3 PC对MDA的影响 H2O2与HUVEC共同孵育后,细胞膜的脂质过氧化反应明显加剧,给予VitC、PC对损伤所致的MDA增加有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性,见表2。
　　2.4 PC对NO含量的影响 H2O2与HUVEC共同孵育后,细胞培养液内NO水平降低,而VitC、PC作用于HUVEC后,NO水平升高,并呈浓度依赖性,见表2。

　3 讨论
　　动脉粥样硬化(artherosclerosis,AS)及其并发症是心脑血管系统疾病中占了相当比重。AS主要累及大中动脉,可致管壁变硬,管腔狭窄,并引起一系列继发性病变,特别是发生在心和脑等器官,常导致管腔闭塞或管壁破裂出血等严重后果[8]。因此它一直是人们研究心血管疾病发生和探索防治措施的热点。有研究证实,EC的损伤及功能异常是AS发生发展的早期事件[2],体内活性氧的存在对内皮细胞的凋亡起了重要作用,因此寻找和开发可以对抗EC的氧化应激损害,抑制EC凋亡或死亡的药物对于临床应用有着重要意义。
　　原花青素是存在于植物体内的天然抗氧化物,主要分布在如葡萄、花生、银杏、单子山楂、白桦树、番荔枝等植物中。葡萄籽原花青素提取物(grape seed pmanthoeyanidin extract,GSPE)目前研究最多,其中原花青素含量可高达95%。近年来研究发现PC具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、预防心血管疾病等多种生物活性、药理作用和临床疗效[9]。本实验旨在研究PC对氧化损伤的HUVEC是否具保护作用及其保护机制。
　　LDH在正常状态下处于细胞胞质内,其含量非常丰富,并不能通过细胞膜,但当细胞受到损伤或死亡时,细胞膜通透性增强,便可将其释放到细胞外,是细胞损伤后的敏感代谢产物,其活性反映了细胞受到损伤的严重程度。自由基侵害细胞后,与多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化,产生脂质过氧化物,如MDA等,MDA的含量水平反映了氧自由基的水平以及脂质过氧化严重程度。自由基氧化损伤细胞后,MDA产生增加,细胞质膜的通透性增加,LDH漏出细胞外也增多。MTT参与活细胞线粒体的能量代谢,它的形成反映了细胞线粒体的代谢活力[10],也能反映细胞增殖与存活状态。本实验研究发现,H2O2减少HUVEC的甲臜形成,而在损伤前加入不同剂量的PC可促进甲臜形成,说明PC具有抗H2O2诱导的HUVEC损伤作用。H2O2可导致HUVEC产生的LDH和MDA增多,表明H2O2能引起HUVEC的氧化损伤,同时也抑制了细胞的增殖代偿能力。据本研究实验结果可见,原花青素可以减轻H2O2引起的HUVEC的损伤,使LDH活力和MDA含量降低,其机制可能是由于保护了HUVEC的线粒体完整,抑制脂质过氧化过程,保护了内皮细胞膜的完整性。
　　EC分泌的NO是重要的细胞保护因子之一,能够抑制血细胞对内皮细胞的粘附和损伤,及调节血管张力等作用[11]。Canipan等[12]的发现,内膜损伤面积减少与血管NO的活性呈正相关,说明NO活性的恢复能够减轻内膜损伤。本实验研究发现,H2O2损伤细胞后NO含量减少,而加入PC组能够促进H2O2诱导后的NO水平升高,并具有浓度依赖性,其可能是由于保护HUVEC并促进损伤的细胞功能的恢复。其促NO生成的具体机制有待进一步实验证实。
　　本研究发现,PC可明显保护H2O2氧化损伤的HUVEC,从而保持内皮功能结构的相对稳定性,发挥内皮细胞维持血管稳态,可减弱由活性氧加剧动脉粥样硬化的一系列病理机制,降低急性冠脉综合征(ACS)发生发展的危险性。此作用机制可能是通过减轻内皮细胞的脂质过氧化,并提高NO水平来实现的。
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　　(收稿日期:2012-04-25) (本文编辑:陈丹云)