沉默VEGF基因对腺样囊性癌细胞侵袭的效果观察

　涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，约占口腔恶性肿瘤的六分之一。腺样囊性癌具有嗜神经侵袭以及跳跃性转移的特点。手术预后差，侵袭以及转移是患者的主要病因之一[1-2]。
　　血管内皮生长因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一种强烈诱导血管生成的细胞因子，在肾癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、膀胱癌、子宫内膜癌以及胚胎组织性肿瘤中多有报道。肿瘤组织中VEGF表达水平与恶性程度成正相关，并明显高于非肿瘤组织[3-4]。这表明VEGF可能通过促进血管形成等方式促进肿瘤的生长，尤其在高度血管化的肿瘤中。VEGF及其受体是血管生成的关键因子，其过度表达与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切[5]。
　　1 资料与方法
　　1.1 细胞培养 腺样囊性癌细胞系低转移株（ACC-2）由中山大学附属孙逸仙医院李劲松教授馈赠。两株细胞培养于10%的FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM培养液，置于37 ℃，5%（v/v）CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。
　　1.2 siRNA的设计和转染 VEGF特异性干扰片段参照之前文献设计。片段序列为：GGCGTCGCACTGAAACTTT，由吉玛生物合成。
　　1.3 mRNA的提取和检测 细胞株的mRNA的提取和cDNA的合成。TRIzol法提取细胞株中总的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反转录试剂盒（Promega）。VEGF引物的设计如下：VEGF基因：上游引物：5’-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3’；下游引物：5’-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3’。内参GAPDH基因：上游引物：5’-GCCTCAAGATCATCAGCAATGC-3’；下游引物：5’-CATGGACTGTGGTCATGAGTCTT-3’。
　　1.4 Western Blot检测VEGF蛋白的表达 分别收集转染48 h后的ACC-2细胞，用预冷的PBS洗涤，加入蛋白裂解液，提取总蛋白。分别取50 μg蛋白，97 ℃变性后，经10% SDS-PAGE分离，将凝胶置于转移平衡缓冲液中，再以200 V行电泳跑胶，时间1 h。再以25 V电压1.5 h将蛋白转移到PVDF膜上；5%脱脂牛奶（TBST溶解）封闭1 h；10%FBS/TBST加一抗4 ℃孵育过夜；漂洗TBST 3次，
　　10 min/次；10%FBS/TBST加二抗室温下孵育1 h，漂洗TBST 3次，10 min/次。取等量的ECL发光试剂A、B液，混匀后，孵育硝酸纤维素膜，曝光，以GAPDH为内参。
　　1.5 Transwell实验 细胞培养至对数生长期，以无血清的DMEM培养基培养细胞，“饥饿”12 h。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，用无血清DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度至5×105个/mL单细胞悬液。取细胞悬液100 ?L加入Transwell小室，设3个复孔。24孔板下室加入450 ?L含10%FBS的细胞培养基。细胞培养48 h，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。采用0.1%结晶紫染色。选择相同位置的3个视野进行计数。
1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 检测结果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白产物在转染后，实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。
　　3 讨论
　　血管内皮生长因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一种强烈诱导血管生成的细胞因子，VEGF的表达广泛见于肿瘤及非肿瘤的病理过程中，它的表达与转化生长因子B（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、NO以及一些重金属离子有关，还受缺血和缺氧环境的调节[6]。肿瘤组织中VEGF表达水平与[第一论文网提供专业写作论文和发表论文服务.]恶性程度成正相关，并明显高于非肿瘤组织[7]。这表明VEGF可能通过促进血管形成等方式促进肿瘤的生长，尤其在高度血管化的肿瘤中[8-10]。VEGF及其受体是血管生成的关键因子，其过度表达能从多方面影响肿瘤的脉管生成，加速肿瘤转移，与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切[11-12]。本研究通过沉默VEGF基因从而降低ACC-2的侵袭能力。揭示了VEGF的对ACC-2侵袭的调控能力，但针对ACC-2侵袭的调控的具体信号通路还需要做进一步的研究。并且需要做动物实验验证，希望以后可以为以VEGF为靶点的恶性肿瘤的生物治疗提供理论的依据。
　　参考文献
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