慢性胃炎脾胃湿热证与热休克蛋白70和核因子

作者：胡玲, 崔娜娟,罗琦,周正, 劳绍贤

【摘要】 　　【目的】观察慢性胃炎患者胃黏膜炎症改变和热休克蛋白70(hsp70)、核因子κb(nfκb)及其下游炎症因子白细胞介素8（il8）、肿瘤坏死因子α（tnfα）蛋白水平的表达,并以脾气虚证为对照,探讨脾胃湿热证与hsp70及nfκb炎症通路表达的关系。【方法】临床收集慢性胃炎患者51例(包括脾胃湿热证36例、脾气虚证15例),另招募正常志愿者8例作为正常对照组。胃镜下取胃窦黏膜,采用苏木素—伊红（he）染色检测炎症改变,快速尿素酶和美蓝法检测幽门螺杆菌(hp)感染,抗生蛋白链菌素—生物素免疫组织化学法检测各组hsp70、nfκb、il8及tnfα蛋白水平表达。【结果】脾胃湿热证与脾气虚证hp感染率相当,但脾胃湿热证hp感染程度及炎症程度均较脾气虚证明显,尤以脾胃湿热证hp阳性患者炎症程度最重；胃黏膜炎症程度及活动度与hp感染呈正相关。脾胃湿热证患者hsp70、nfκb、il8及tnfα表达均较脾气虚证显著升高(p ＜0.05)。从hp感染与hsp70及nfκb炎症通路情况看,脾胃湿热证hp阳性患者hsp70、nfκb表达显著高于hp阴性患者(p ＜0.05)；尽管脾胃湿热证hp阳性患者il8、tnfα表达与hp阴性患者之间的差异无显著性意义,但也呈增高趋势。胃黏膜hp感染与hsp70、nfκb及il8表达呈一定程度的正相关,但与tnfα表达无明显相关性。【结论】慢性胃炎脾胃湿热证的发生与胃黏膜hsp70及nfκb炎症通路的表达相关。hsp70与nfκb及其下游炎症因子在胃黏膜的过表达可能部分体现了慢性胃炎脾胃湿热证“邪正交争”的亢奋状态；相比之下,慢性胃炎脾胃湿热证hp阳性患者“邪正交争”更为剧烈。

【关键词】 慢性胃炎；脾胃湿热；脾气虚；胃黏膜/病理学

　　abstract: objectiveto observe inflammatory changes and expression levels of heat shock protein 70 (hsp70) and nuclear factorkappa b (nfκb) as well as the correlated inflammatory factors of interleukin 8 (il8) and tumor necrosis factor alpha (tnfα) in gastric mucosa of chronic gastritis patients, and to explore the relationship of spleenstomach dampheat syndrome with hsp70 and nfκb inflammatory pathway. methodsfiftyone chronic gastritis patients were enrolled into the study. of them, 36 patients were classified into spleenstomach dampheat syndrome and 15 into spleenqi deficiency syndrome. eight healthy volunteers served as the control. gastric mucosa was sampled under gastroscope. he staining was applied for the inflammatory changes of gastric mucosa. helicobacter pylori (hp) infection of gastric mucosa was detected by fast urea enzyme and methylene blue method. the protein expression of hsp70, nfκb, il8 and tnfα in gastric mucosa was detected by streptavidinbiotin complex(sabc) immunohistochemical method. resultsthe gastric mucosal hp infection rate in patients with spleenstomach dampheat syndrome was similar to that in patients with spleenqi syndrome. however, patients with spleenstomach dampheat syndrome had severer hp infection and inflammatory changes than those in patients with spleenqi syndrome. the inflammatory changes were more obvious in spleenstomach dampheat patients with hp infection positive. the inflammatory degree and activity of gastric mucosa was positively correlated with hp infection. the protein expression level of hsp70, nfκb, il8 and tnfα in gastric mucosa of patients with spleenstomach dampheat syndrome was higher than that in patients with spleenqi deficiency syndrome（p＜0.05）. in regards of relationship of hp infection with the condition of hsp70 and nfκb inflammatory pathway, spleenstomach dampheat syndrome patients with hp positive had higher hsp70 and nfκb expression levels than those with hp negative (p＜0.05). the expression of il8 and tnfα showed an increasing trend in spleenstomach dampheat syndrome patients with hp positive as compared with that in hp negative patients, but the difference was insignificant. gastric mucosal hp infection was positively correlated with hsp70, nfκb and il8 expression to some extent, while was not correlated with the expression of tnfα. conclusionthe occurrence of spleenstomach dampheat chronic gastritis is related with hsp70 and nfκb inflammatory pathway of gastric mucosa. the overexpression of gastric mucosal hsp70 and nfκb and their associated inflammatory factors maybe partially reflect the excited state of the struggling of healthy qi or pathogenic qi in spleenstomach dampheat chronic gastritis patients, which is more obvious in those patients with hp positive.

　　key words: chronic gastritis; spleenstomach dampheat;

　　作为内源性保护蛋白,热休克蛋白70(heat shock protein70,hsp70)对维持胃黏膜的完整有重要作用［1］，核因子κb(nuclear factor κb,nfκb)活化后的表达与胃黏膜炎症密切相关［2］。本研究以hsp70及nfκb炎症通路的表达为切入点,并以脾气虚证为对照,探讨慢性胃炎脾胃湿热证发生的生物学机制，现报道如下。

　　1资料与方法

　　1.1病例资料收集2007年6月至10月就诊于广州中医药大学第一附属医院消化内科门诊属于慢性胃炎患者51例，辨证为脾胃湿热证者36例,其中幽门螺杆菌(helicobacter pylori,hp)感染阳性者19例,hp阴性者17例；男23例,女13例；平均年龄为(35.36±5.70)岁；平均病程为(1.90±1.00)年。辨证为脾气虚证者15例,男5例,女10例；平均年龄为(33.31±7.35)岁；平均病程为(2.17±0.77)年。另招募正常志愿者8例作为正常对照组，男3例,女5例；平均年龄(31.88±2.23)岁。3组在性别、年龄以及脾胃湿热证与脾气虚证患者的病程之间差异均无显著性意义(p>0.05)。

　　1.2诊断标准慢性胃炎的诊断采用中华医学会消化病学学会制定的《全国慢性胃炎研讨会共识意见》中的标准［3］，脾胃湿热证和脾气虚证的辨证诊断参照《中药新药临床研究指导原则》(试行)标准［4］，hp感染判断参照2003桐城会议标准［5］。

　　1.3纳入标准符合上述诊断标准，年龄在18~50岁之间，自愿且能够配合参加试验的受试者,并签署知情同意书。

　　1.4排除标准不符合上述诊断标准者；近1个月内使用过抗生素、铋剂、h2受体拮抗剂及质子泵抑制剂治疗者；合并消化性溃疡、萎缩性胃炎、食管炎、食管静脉曲张、肝炎、肝硬化等消化系统疾病者；合并有严重心、肝、肾、肺系等疾病者及孕妇、哺乳期妇女；年龄在50岁以上或18岁以下者。

　　1.5主要试剂及仪器鼠抗人hsp70单克隆抗体（由北京中杉金桥生物有限公司提供，批号:77091220),鼠抗人nfκb/p65单克隆抗体（购自美国santa cruz公司，批号:sc8008),兔抗人白细胞介素8（il8）亲和纯化抗体（由博士德生物工程有限公司提供，批号：ba0996),兔抗人多克隆抗体肿瘤坏死因子α（tnfα）（购自北京博奥森公司，批号:bs0078r),gifxq240型电子胃镜及bx50f3双目显微镜(附带自动照相装置nikon e990)均由日本奥林巴斯公司提供。

　　1.6问卷调查各组受试对象均完成临床观察表,由专人询问,对症状进行评定计分并填写表格。为准确记录患者症状,对于不容易准确判断的舌象、脉象,均由2位以上有经验的医师复核。

　　1.7标本收集各组受试对象均行胃镜检查,于胃窦距幽门2～3 cm处的大弯和小弯钳取胃黏膜组织共2块,1块立即进行hp快速尿素酶和美蓝法检测，1块放入40 g/l多聚甲醛中固定,石蜡包埋，行胃黏膜炎症、hp感染病理组织学及上述各指标免疫组织化学标记检测。

　　1.8指标检测

　　1.8.1胃黏膜炎症检测采用常规苏木素—伊红（he）染色方法进行。胃黏膜炎症程度、活动度的判断采用文献［3］标准,由2位病理医师在同一设定条件和未知病理诊断情况下进行。

　　1.8.2胃黏膜hp感染检测采用快速尿素酶和美蓝法进行,两种方法检测均呈阳性者判断为hp感染阳性,而均呈阴性者判断为hp阴性,一阴一阳者不纳入结果分析。

　　1.8.3胃黏膜hsp70及nfκb通路的检测采用抗生蛋白链菌素—生物素(streptavidinbiotin complex, sabc)免疫组织化学标记方法进行。hsp70、nfκb、il8及tnfα一抗的工作浓度为1∶100,并于4℃过夜,其他具体操作步骤按试剂盒说明书进行。胃黏膜上述指标表达染色指数的观察采用北航图像分析系统3000进行病理图像分析。染色指数（i染色）计算：染色指数＝染色强度×染色面积；按显色强弱记录为：阴性-0,弱阳性-1,阳性-2,强阳性-3；染色面积比为染色细胞数占总体细胞数的百分比。

　　1.9统计学方法采用spss for windows 16.0统计软件包进行数据的分析。以均数±标准差（±s）表示,组间均数比较用t检验；多组间计量资料比较用方差分析,等级资料用秩和检验；相关分析用spearman等级相关分析方法。显著水平设α＝0.05。

　　2结果

　　2.1各组hp感染与胃黏膜炎症程度、活动度的情况脾胃湿热证患者黏液糊大多量偏多而浊,部分伴糜烂或黏膜下出血点；其胃黏膜充血水肿及炎症程度均重于脾气虚证,但炎症活动度则2组之间未见明显差异。脾胃湿热证与脾气虚证患者胃黏膜hp感染率相当,分别为52.78%和53.33%,但脾胃湿热hp阳性患者炎症程度及活动度均较hp阴性患者明显,胃黏膜炎症程度及活动度与hp感染的相关系数分别为0.608和0.620,呈正相关；hp阳性患者胃黏膜除固有层炎症细胞浸润、上皮破坏外,部分还可见淋巴滤泡形成。结果见表1~表4及图1~图2（见彩图页第669页）。表1各组胃黏膜的炎症程度（略）表2脾胃湿热证hp感染与胃黏膜炎症程度的关系（略）表3各组胃黏膜的炎症活动度（略）表4脾胃湿热证hp感染与胃黏膜炎症活动度的关系（略）

　　2.2各组胃黏膜hsp70及nfκb炎症通路的表达脾胃湿热证和脾气虚证患者hsp70、nfκb及il8蛋白水平的表达定位于胃黏膜上皮、腺体及固有膜细胞的胞核和胞浆,tnfα蛋白水平的表达主要定位于胃黏膜上皮、腺体及固有膜细胞的胞浆；正常对照组各指标的表达主要定位于胃黏膜上皮、腺体及固有膜细胞的胞浆。脾胃湿热证患者hsp70、nfκb、il8及tnfα表达均显著高于脾气虚证组(p ＜0.05)。从hp感染与hsp70及nfκb炎症通路情况看,脾胃湿热证hp阳性患者hsp70、nfκb表达显著高于hp阴性患者(p ＜0.05)；尽管il8、tnfα表达与hp阴性患者之间未见显著差异,但其表达也呈增高趋势。本研究病例胃黏膜hp感染程度与hsp70、nfκb及il8表达的相关系数分别为0.322、0.288和0.277,呈一定程度正相关；与tnfα表达的相关系数为0.064,未见明显的相关性。结果见表5、表6及图3~图6（见彩图页第670页）。表5各组胃黏膜hsp70、nfκb、il8及tnfα免疫组化的表达比较(略)表6脾胃湿热证hp感染与胃黏膜hsp70、nfκb、il8及tnfα表达的关系(略)

　　3讨论

　　hp是造成胃黏膜损伤的主要攻击因子之一,与慢性胃炎、溃疡甚至胃癌均具有明确的病因学联系［6－7］。作为重要的转录调控因子,nfκb活化入核后能与炎症反应基因启动子部位的κb位点特异性结合,启动和调节相关炎症基因转录,在炎症反应细胞因子网络调节通路中起重要作用。研究显示,hp感染易导致nfκb活化，而随着nfκb活化后在胃黏膜表达的增加,炎症性细胞因子il8及tnfα表达也逐渐上升，且后者还可进一步促进nfκb的活化,产生级联反应,从而使炎症持续和放大［2,7－8］，这与中医认为“湿热邪气”具有熏蒸、粘滞以及致病隐匿、渐进和缠绵易反复的特点较类似。

　　众所周知,中医在强调“邪气”致病的同时,往往更加注重机体“正气”的御邪能力。作为内源性保护蛋白,hsp70在维持胃黏膜的完整中有着重要作用［1］。已有研究发现,hp阳性患者胃黏膜hsp70表达随hp感染程度的加重而增强［9］；hsp70可通过nfκb通路调节脂多糖所诱导的炎症性细胞因子的表达［10］。笔者于此也曾提出hp感染可能通过激活nfκb通路,使相关炎症因子过表达而致病，而hsp70则可能通过介导细胞保护,阻止nfκb活化从而能一定程度提高胃黏膜对hp和相关炎症因子的防御和耐受能力的观点［11］。本课题组近期mrna水平定量研究也提示,慢性胃炎脾胃湿热证患者胃黏膜hsp70及nfκb的表达明显高于脾气虚证组和正常对照组［12］。

　　从本研究病例看,慢性胃炎脾胃湿热证与脾气虚证hp感染率相当,但脾胃湿热证hp感染程度及胃黏膜炎症程度较脾气虚证为重,尤其以脾胃湿热证hp阳性患者的炎症程度最重。脾胃湿热证和脾气虚证组患者胃黏膜hsp70与nfκb及其下游炎症因子il8、tnfα蛋白水平的表达分别较正常对照组升高和下降；与正常对照组仅呈胞浆未活化状态的表达不同,2组hsp70、nfκb及其il8均呈胃黏膜上皮、腺体和固有膜活化后细胞核和胞浆的同时表达,且2组之间的表达存在着显著性差异，一定程度体现了脾胃湿热证邪气亢盛与正气奋起抗邪以及脾气虚证正虚体弱不足以奋起抗邪的特点。从与hp感染的相关性来看,胃黏膜炎症程度和活动度以及hsp70、nfκb及其炎症因子il8表达均与hp感染程度呈一定的正相关；但tnfα表达与hp感染程度未见明显相关性,是否与tnfα体内效应呈表达量依赖性有关,尚待进一步的探讨。

　　上述研究初步提示,慢性胃炎脾胃湿热证的发生与hsp70和nfκb及其炎症通路相关；相对而言,hp阳性脾胃湿热证患者的炎症反应最为明显；具有胃黏膜保护作用的hsp70可能部分体现了机体正气的作用,而nfκb及其下游炎症因子则可能部分体现了体内邪气的力量。根据hp的致病性、hsp70本身的特点及其在本研究病例中医证候的表达,结合前期的相关研究,本研究进一步提出hp可能属中医“湿热邪气”,而hsp70可能属“正气”范畴的观点；并初步认为hsp70与nfκb及其下游炎症因子在胃黏膜的过表达可能部分体现了慢性胃炎脾胃湿热证“邪正交争”的亢奋状态；相比之下,慢性胃炎脾胃湿热证hp阳性患者“邪正交争”更为剧烈。

【参考文献】
　　［1］choi s r, lee s a, kim y j, et al. role of heat shock proteins in gastric inflammation and ulcer healing［j］. j physiol pharmacol,2009，60(7)：5．

　　［2］doqer f k, meteoqlu i, ozkara e, et al. expression of nfkappa b in helicobacter pylori infection［j］. dig dis sci,2006,51(12)：2306．

　　［3］中华医学会消化病学学会. 全国慢性胃炎研讨会共识意见［j］. 中华消化杂志,2000,20(3)：199．

　　［4］国家食品药品安全监督管理局.中药新药临床研究指导原则(试行) ［s］. 北京：中国医药科技出版社,2002：362,371．

　　［5］中华医学会消化病学分会. 幽门螺杆菌共识意见［j］. 中华消化杂志,2004,24(2)：126．

　　［6］ding s z, goldberg j b, hatakeyama m. helicobacter pylori infection, oncogenic pathways and epigenetic mechanisms in gastric carcinogenesis［j］. future oncol,2010，6(5)：851.

　　［7］yanai a, maeda s, shibata w,et al. activation of ikappab kinase and nfkappab is essential for helicobacter pyloriinduced chronic gastritis in mongolian gerbils［j］. infect immun, 2008,76(2)：781．

　　［8］kim s y, lee y c, kim h k, et al. helicobacter pylori caga transfection of gastric epithelial cells induces interleukin8［j］. cell microbiol, 2006,8(1)：97．

　　［9］yi p, li g c, liu s h, et al. effect of xiaokuiling prescription on the expression of hsp72, hsp b in gastric mucosa of patients with helicobacter pyloriassociated duodenal ulcer［j］. j tongji med univ, 2001,21(4)：310．

　　［10］dokladny k, lobb r, wharton w, et al. lpsinduced cytokine levels are repressed by elevated expression of hsp70 in rats: possible role of nfkappa b［j］. cell stress and chaperones, 2010,15(2)：153．

　　［11］胡玲,劳绍贤,邝枣园,等.对幽门螺杆菌相关胃病脾胃湿热证发生机制的思考［j］. 中西医结合学报,2008,6(6):565．

　　［12］崔娜娟,胡玲,劳绍贤,等. 慢性胃炎脾胃湿热证与核因子κb mrna、热休克蛋白70 mrna关系的研究［j］. 中国中西医结合杂志,2010，30(1)：18．

本文链接：http://www.qk112.com/lwfw/yxlw/linchuangyixue/97952.html