黄连解毒汤对动脉粥样硬化大鼠单核细胞趋化蛋

作者：黄萍，郭重仪，李国强，程穗茗，罗承锋，刘世明

【摘要】 　　【目的】观察黄连解毒汤对动脉粥样硬化（as）大鼠主动脉组织中单核细胞趋化蛋白1（mcp1）及其特异性受体ccr2mrna表达的影响。【方法】选用sd大鼠，随机分为正常对照组，模型组，黄连解毒汤低、中、高剂量组（中药组，剂量分别为2.7、5.3、10.6g·kg-1·d-1），阿托伐他汀组（剂量为1.8mg·kg-1·d-1）。除正常对照组外，其他组均采用高脂饮食法复制as模型，造模第6周开始给药，连续4周。取各组大鼠主动脉采用实时荧光定量pcr法检测各组mcp1/ccr2mrna表达。【结果】与正常对照组比较，模型组主动脉mcp1/ccr2 mrna表达显著升高（p＜0.05或p＜0.01）；与模型组比较，黄连解毒汤各剂量组mcp1/ccr2 mrna表达均显著降低（p＜0.05或p＜0.01），且呈一定的剂量效应关系，mcp1与ccr2两者表达呈正相关。【结论】黄连解毒汤治疗as的作用可能与其能下调mcp1、ccr2 mrna在主动脉的表达有关。

【关键词】 黄连解毒汤/药理学；动脉粥样硬化/中药疗法；疾病模型，动物；大鼠

　　abstract: objectiveto investigate the effect of huanglian jiedu decoction（hjd） on the expression of monocyte chemoattractant protein1（mcp1） and its specific receptor ccr2 mrna in rats with atherosclerosis（as）. methodssd rats were randomized into normal control group，model group，atorvastatin（1.8 mg·kg-1·d-1） group，and low，moderate and highdosage hjd（in the dosages of 2.7，5.3 and 10.6 g·kg-1·d-1，respectively） groups. rats except for the normal group were given highfat diet to induce as. in the 6th week of modeling，the rats were given the corresponding medicine according to the experimental design for 4 continuous weeks. the expression of mcp1/ccr2 mrna in rats aorta was detected by the method of realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction（rtpcr）. resultscompared with the normal control group，the expression of aortic mcp1/ccr2 mrna was increased in the model group（p<0.05 or p<0.01）. the expression of aortic mcp1/ccr2 mrna was significantly lower in hjd groups than that in the model group（p<0.05 or p<0.01），in a dosedependent manner. the expression of mcp1 was positively correlated with ccr2 mrna expression. conclusionthe therapeutic mechanism of hjd for as is probably related with the downregulation of aortic mcp1/ccr2 mrna.

　　key words:huanglian jiedu decoction/pharmacology；atherosclerosis/tcd therapy；disease models，animal；

　　近年来大量研究提示炎症与动脉粥样硬化（as）的发生发展关系密切［1］。单核细胞趋化蛋白1（mcp1）及其特异性受体ccr2是与炎症、感染等相关的重要调节因子［2-3］。黄连解毒汤被视为清热解毒的代表方，源于《外台秘要》，主要用于治疗相当于热毒证的感染性疾病，在治疗心脑血管疾病如高血压、冠心病、糖尿病、缺血性脑血管病以及血管性痴呆等慢性退行性疾病方面也有良好作用 ［4-5］。本实验观察了mcp1/ccr2与as发病的关系及黄连解毒汤的调节作用。现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物sd大鼠，雄性，体质量150~180g，spf级，由广东省实验动物中心提供，合格证号：scxk（粤）20030002，粤监证字2008a020。

　　1.2实验药物立普妥（阿托伐他汀钙片）购自美国辉瑞制药公司，胆维丁乳（维生素d3）购自上海信谊金朱药业有限公司。黄连解毒汤的制备：黄连、黄柏、黄芩、栀子以3∶2∶2∶3（质量比）的比例煎煮，分2次煎煮，第1次60min（并过滤），第2次30 min（并过滤），合并2次滤液，浓缩到1g/ml备用。

　　1.3仪器及试剂prism7300荧光定量pcr仪（abi公司），超低温冰箱（日本三洋公司），总rna抽提试剂（美国mrc公司），逆转录试剂、实时荧光定量pcr试剂均购自立陶宛fermentas公司，mcp1、ccr2、gapdh引物（上海英骏生物技术有限公司）。

　　1.4模型复制及分组将sd大鼠随机分为正常对照组，模型组，黄连解毒汤低、中、高剂量组（中药组，剂量分别为2.7、5.3、10.6g·kg-1·d-1），阿托伐他汀组（剂量为1.8mg·kg-1·d-1）。除正常对照组外，其他组均采用高脂饮食法复制as模型：以高脂饲料喂养8周（配方：酪蛋白、l胱氨酸、黄豆粉、果糖、蔗糖、草粉、豆油、猪油、矿物质、磷酸氢钙、柠檬酸钠、多维、贝壳粉、蛋黄粉、胆固醇、去氧胆酸钠、胆盐），同时在第2、4、6周灌胃维生素d3溶液（2.0×104u·次-1·只-1），正常对照组喂普通大鼠饲料。从造模第6周开始每天灌胃给药1次，正常对照组灌服等容积蒸馏水，连续给药4周。

　　1.5标本采集及处理实验结束处死动物，取主动脉，去除上面附着组织，称取50mg，将标本浸入含有1mltrizol的ep管中，-80℃保存，备用。

　　1.6mcp1/ccr2 mrna的检测

　　1.6.1引物的设计引物在genebank查到基因序列，使用软件primer express 3.0进行设计。mcp1上游引物：5tgtcccaaagaagctgtagtatttgt3，下游引物：5ttctgatctcacttggttctggtc3，扩增片段为120 bp。ccr2上游引物：5ggaatcttcttcattatcctcctgac3 ，下游引物物：5tgactacacttgttattaccccaaagg3，扩增片段为112bp。内参gapdh上游引物：5actgagcatctccctcacaattc3，下游引物：5tgcagcgaactttattgatggtat3 ，扩增产物长1307bp。

　　1.6.2rna提取和cdna合成使用trizolrna提取液，按照其说明书提取总rna，提取的rna质量由d260 /d280 比值和20g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定。在pcrsystem扩增仪上按sybr，rtpcr kit反转录试剂说明书进行cdna的合成，反应体系为10μl，包括：5倍pcr buffer2μl、三磷酸脱氧核糖核苷（dntp）1μl、primer（oligodt）0.5μl、inhibiter0.5μl、逆转录酶0.5μl、1g/l焦碳酸二乙酯（depc）水0.5μl、rna模板5μl，反应条件为：反转录反应42℃、1h，反转录酶的失活反应70℃、10min。

　　1.6.3实时荧光定量pcr法gapdh、mcp1、ccr2 mrna的pcr反应：引物按40倍稀释，反应体系为25μl，包括上游引物 0.25μl、下游引物 0.25μl、sybr green realtime pcr master mix12.5μl、cdna2μl、1g/ldepc水 10μl。反应条件：第1步是预变性，95℃、1min，1个循环。第2步是pcr反应，95℃、15s，60℃、1min，共40个循环，95℃、15s，60℃、30s，95℃、15s，1个循环。第3步是循环结束后72℃延伸10min。整个过程中收集荧光，反应结束后，使用7300 system sds software软件分析pcr过程中各检测样本threshold cycle（ct）值，ct值随模板浓度增大而减少。由溶解曲线判断pcr反应的特异性。样本mrna含量（copies/ml）相对值=样本quantity copies/gapdh quantity copies。

　　1.7统计学方法采用spss 13.0软件包进行统计分析。

　　2结果

　　各组大鼠主动脉mcp1/ccr2 mrna表达情况：模型组与正常对照组比较，主动脉mcp1/ccr2 mrna表达显著升高（p＜0.05或p＜0.01）；黄连解毒汤及阿托伐他汀组mcp1/ccr2 mnra表达较模型组显著降低（p＜0.05或p＜0.01），且呈一定的剂量依赖关系，mcp1与ccr2两者表达呈正相关。结果见表1及图1~图3（见彩图页第665页）。表1各组大鼠主动脉mcp1/ccr2 mrna表达比较(略)

　　3讨论

　　1976年，ross提出了动脉粥样硬化（atherosclerosis，as）形成的炎症学说。as从粥样硬化斑块形成到斑块破裂，以至血栓形成的各个阶段，都有不少炎症细胞和炎症介质参与。当血管内皮因病原微生物感染、脂质浸润等因素致损伤后，局部发生炎症反应，这些炎症因子作为一种介质，使参与as形成的内皮细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞、血小板相互联系，相互影响，使病变得以发生发展［1］。
　
　　mcp1属于趋化因子cc亚家族，其主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位，mcp1的趋化作用通过ccr2完成。

　　hoogeveen等［2］研究血浆mcp1水平与外周动脉疾病或冠状动脉粥样硬化性心脏病之间关系时发现，mcp1随动脉粥样硬化程度增加而增加，mcp1是心血管疾病的独立危险因素。近年来的研究显示［3-5］，构成as病变的主要细胞如单核细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞均能表达mcp1，并特异性地作用于外周血中的单核细胞，招募其迁移至内皮下，构成as发生发展的重要机制。阻断mcpl作用的治疗措施能阻止早期血管炎症反应和稳定斑块［6］。

　　近年来，单味中药（如黄芩、知母、葛根等）治疗冠状动脉粥样硬化的研究已经证实，清热解毒中药治疗冠状动脉粥样硬化是有效的［7］。本研究结果显示：黄连解毒汤对炎症反应中的炎症因子有调节作用，通过抑制单核细胞的激活，进而抑制mcp1的产生，阻断炎症因子mcp1/ccr2的表达。前期研究也表明，黄连解毒汤对动脉粥样硬化大鼠血清中细胞间黏附分子1（icam1） 和血管细胞粘附分子1（vcam1）水平均有降低的作用［8］，并可上调cd4+cd25+treg表达［9］。本研究结果表明，黄连解毒汤能显著降低动脉粥样硬化大鼠主动脉的mcp1/ccr2 mnra表达，且呈一定的剂量依赖关系。提示黄连解毒汤可通过减轻局部的炎症反应，从而对血管内皮细胞起到保护作用，延缓动脉粥样硬化的进程。

【参考文献】
　　［1］张小梅，翟桂兰． 炎症因子与动脉粥样硬化的研究进展［j］． 牡丹江医学院学报，2008，29（1）：91．

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　　［3］siebert h，sachse a，koziel w a，et a1．the chemokine receptor ccr2 is involved in macrophage recruitment to the injured peripheral nervous system［j］． j neunroimmunol，2000，110（1~2）：177．

　　［4］吴辉，刘煌德，吴伟．清热解毒法对肺炎衣原体感染致兔动脉粥样硬化的干预作用［j］．广州中医药大学学报，2006，23（2）：151．

　　［5］方青，詹小萍，莫剑翎，等．黄连解毒汤对ad大鼠的治疗作用及对细胞因子含量的影响［j］．中国中药杂志，2004，29（6）：575．

　　［6］braisier a r，recinos a，eledrisi m s．vascular inflammation and the reninangiotensin system［j］．arterioscler thromb vasc biol，2002，22（8）：1257．

　　［7］刘彦珠，罗国安，龙致贤，等．清热解毒药对血管平滑肌细胞增殖、细胞周期的影响［j］．清华大学学报（自然科学版），2000，40（6）：13．

　　［8］李国强，黄萍，程穗茗，等．黄连解毒汤对动脉粥样硬化大鼠sicam1和sicam的影响［j］． 广东医学，2009，30（11）:1604．

　　［9］李国强，黄萍，程穗茗，等．黄连解毒汤对动脉粥样硬化cd4+cd25+treg表达的影响［j］． 广东医学，2010，31（3）:329．

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