普罗帕酮对HERG钾通道孔胞膜外侧氨基酸突变前后

【摘要】 目的：探讨普罗帕酮对人类etheragogo相关基因（herg）钾通道孔道胞膜外侧突变后结合能力的影响。方法： 将herg野生型通道（wt）和herg突变型通道（mt）的互补核糖核酸（crna）注射到非洲爪蟾卵母细胞，孵育24～72h后以不同刺激程序用双微电极法记录通道电流的表达。用clampfit 9.2版本软件对数据进行分析。部分电流用相应的方程拟合。结果：herg wt外侧的第628位点的甘氨酸突变为半胱氨酸（g628c）和第631位点的丝氨酸突变为半胱氨酸（s631c）成herg mt后普罗帕酮与herg mt通道的结合能力减小，50%抑制浓度（ic50）对herg wt，herg mt分别为5.31μmol/l和7.81μmol/l。普罗帕酮对herg wt和herg mt的阻滞效应都呈电压和浓度依赖性。普罗帕酮减小herg wt，但未减少herg mt通道的半数激活电压。结论：普罗帕酮是herg通道的开放通道阻滞剂，herg通道孔道膜外侧突变（g628c和s631c）能改变普罗帕酮与通道之间的结合能力，从而影响通道的激活。

【关键词】 普罗帕酮；突变；钾通道阻滞剂；心电图描记术

effect of propafenone on herg channel before and after the mutation near the extracellular mouth of the poreli xuyong　li xiaoyan,jiang xuejun,tang yanhong,wang xidepartment of cardiology,people′s　hospital　of wuhan　university　wuhan　hubei　430060,chinaabstract：objective:to discuss the effect of propafenone on herg wt and herg mt channel which had mutation near the extracellular mouth of the s:herg wt and herg wt crnas were injected in xenopus laevis 24～72 hours incubation, currents were recorded by twomicroelectrode voltage clamp technique using different depolarizing data were analyzed with clampfit 9.2 current traces were fitted with corresponding s:the binding ability of propafenone on herg mt channel decreased after g628c and s631c enone′s ic50 were 5.31 mol/l and 7.81 mol/l in herg wt,herg mt enone produce a voltage and concentrationdependent inhibition on both herg wt and herg mt enone reduced the midpoint of activation voltage of herg wt channels but no reduced the midpoint of activation voltage of herg mt sion:propafenone is an open channel blocker of binding affinity to this channel can be reduced by the mutation near the extracellular mouth of the pore(g628c and s631c).

　　key words：propafenone;mutation; potassium channel blockers;electrocardiography

　　长qt综合征（lqts）是一组因心肌细胞复极异常导致的临床综合征，表现为心电图中qt间期延长、相对心动过缓、t波异常或明显u波，可发生室性心律失常或尖端扭转性室速，出现晕厥、心源性猝死等事件[1,2,3]。目前研究发现，人类etheragogo相关基因（herg）突变或药物对herg通道动力学的影响是引起lqts的常见原因。因此研究药物对herg通道的作用和通道突变对其动力学的影响受到广泛关注。

根据通道激活速度的不同，心肌细胞延迟整流性钾电流主要分为快速激活成分ikr和缓慢激活成分iks。其中，ikr是主要由herg通道与其辅助亚基mirp1相互作用，在心肌细胞复极化过程中形成的。herg通道同其它电压依赖性钾离子通道相似，具有6次跨膜结构域，具有较长的n末端和c末端（见图1）[4,5]。herg mt通道外口侧g628c和s631c突变（简称herg mt）（见图1）会导致通道n型失活缺失[6]。
　
herg基因(human etheragogorelatedgene)在心脏组织中广泛表达。在心房和心室肌细胞中，ikr维持和稳定2相和3相期动作电位，促进心肌细胞复极化。其电流的大小决定心肌细胞动作电位时程的长短，电流大则心肌细胞动作电位时程缩短， 而电流小则心肌细胞动作电位时程延长。在动作电位的平台期，herg通道发挥内向整流效应，ikr仅有微小变化，维持动作电位的平台期。在动作电位的后期，失活的herg通道迅速恢复，失活过程却缓慢，因而外向性ikr电流迅速增长，促进了动作电位3相期的完成[7,8]。herg通道特殊的动力学特征决定了其在心肌复极中的重要作用，因此herg通道电流的改变将影响心肌动作电位心电图（ecg）的qt间期。本研究主要通过卵母细胞表达系统，应用双电极电压钳制技术研究普罗帕酮对herg wt和herg mt通道的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 主要试剂配制

　　or2 液(mmol /l) : nacl 82.5、kcl 2、mgcl2 1、羟乙基哌嗪乙璜酸（hepes）5,用naoh调节ph值至7.4,室温保存备用，配成0.1%胶原酶使用; nd96液(mmol/l) : nacl 96、kcl
　　2、cacl2 1.8、mgcl2 1、hepes 10, 用naoh调节ph值至7.4,使用前高温高压灭菌。普罗帕酮使用二甲基亚砜溶解后再用nd96配置成不同浓度备用。

　　1.2 克隆通道的获取

　　本研究中使用了野生型herg通道（herg wt）和herg mt外口侧g628c和s631c突变的通道，通道cdna 质粒经过扩增、提取及纯化、mrna 的转录后备用。

　　1.3 克隆通道的电生理记录

　　手术取非洲爪蟾卵母细胞，置含0.1%胶原酶的or2液中缓慢振摇，直至卵细胞消化为单个细胞。卵母细胞注射herg rna放于nd96液中培养两天后记录通道电流。通道电流的记录采用双微电极钳制法，电极内液为3 mol/l的kcl,电极电阻v1 (钳制电极)为0.3～1mω,vi (记录电极)为0.5～2 mω。细胞外灌流液为nd96,不同浓度的普罗帕酮溶解于nd96中，细胞外液灌流速度1 ml/min,灌流时间为 wt通道的刺激程序为: 钳制电压为-80mv，去极化刺激p1从-80mv开始到+40mv，阶跃10mv，每个刺激持续2s,p1结束后紧跟-40mv,持续2s的p2刺激以引出尾电流。herg mt通道的刺激程序为：钳制电压为-80mv，去极化刺激p1从-80mv开始到+40mv，阶跃10mv，每个刺激持续400ms,p1结束后紧跟0mv,持续400ms的p2刺激以引出尾电流。

　　1.4 实验数据的分析和处理

使用pclamp 9.2软件记录和分析通道电流，采用origin 8.0来拟合曲线和作图。浓度依赖性曲线使用hill方程进行拟合f=bmax/(1+[ic50/d]n)，f为阻断率，bmax为最大阻断率，ic50为半数抑制浓度，d为药物浓度，n为hill系数。i-v曲线标准化电流由不同p1去极电压下2s(herg wt)末或400ms(herg mt)末的电流值除以对照组最大电流峰值得到。用boltzmann方程来拟合激活曲线：i/imax = 1/[1+exp(v1/2 -v)/k]，v1/2是半数激活电压，v为各测试电位，k为曲线斜率。计量资料均采用均数±标准差(±s)表示。两组间数值比较使用配对t检验,p<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 herg wt和herg mt通道的电流特征

图2a和b是野生型和突变型herg通道的典型电流图形。野生型通道p2刺激引出的尾电流要高于p1刺激引出的激活电流，而突变型通道p2刺激引出的尾电流要低于p1刺激引出的激活电流。
　
　　 2.2 通道对普罗帕酮的浓度依赖性

通过使用不同浓度的普罗帕酮灌流，通道电流显示了明显的浓度依赖性。不同浓度的普罗帕酮对通道电流均具抑制作用，50μmol/l的普罗帕酮能阻断herg wt和herg mt电流分别达91.3%和78.8%（+50mv尾电流）。对不同浓度的普罗帕酮作用于herg wt (1、5、10、25和50μmol/l)和herg mt(1、5、10、25和50μmol/l)通道的尾电流（+50mv尾电流），使用hill方程拟合作出浓度依赖性曲线（见图3a和b），得到herg wt和herg mt通道的ic50分别为（5.31±1.31）μmol/l和（7.81±1.45）μmol/l。两者相比有显著差异（p<0.05，n=5）。

　　2.3 普罗帕酮对通道i-v曲线的影响

从图中4可以看出，herg wt大约在－50mv开始激活，至-10mv左右电流达到最大值，然后电流逐渐降低，显示herg通道电流具有内向整流特性。不同浓度的普罗帕酮对herg wt的阻滞均有电压依赖性，-10mv时对通道的阻滞程度最为明显，1、5、10、25和50μmol/l普罗帕酮分别能阻断通道电流达30.0%、51.1%、69.4%、81.2%、86.3%。herg mt大约在-40mv开始激活，而后随着去极电压的增大通道电流也逐渐增大。没有明显的-10mv时最大电流峰值的出现。不同浓度的普罗帕酮对herg mt的阻滞亦具有电压依赖性，50mv时对通道的阻滞程度最为明显，1、5、10、25和50μmol/l普罗帕酮分别能阻断通道电流达4.0%、34.7%、61.7%、79.5%、81.6%。

　　2.4 普罗帕酮对通道稳态激活的影响

尾电流峰值使用boltzmann方程拟合后得到通道的激活曲线，从图5可以看出，普罗帕酮使herg wt通道的激活曲线明显左移，对照组和5.31μmol/l普罗帕酮作用后的的半数激活电压（v1/2）分别为（-19.70±0.09）mv和（-22.26±0.14）mv，两者相比有显著差异（p<0.05，n=5）。而普罗帕酮作用于herg mt通道后，通道的激活曲线未见明显的偏移，对照组和7.81μmol/l普罗帕酮作用后的的半数激活电压分别为（-20.75±0.11）mv和（-20.24±0.21）mv，两者相比无显著差异（p>0.05，n=5）。

3 讨 论

普罗帕酮是临床上广泛应用ic类的抗心律失常药物。研究显示，普罗帕酮能降低动作电位的最大上升速度和幅度，延长动作电位时程[9，10]。herg通道是电压门控钾通道家族成员，其激活和去激活较慢，但其电压依赖性的失活非常快，因此具有显著的内向整流性。此动力学特征使其在心肌动作电位去极化期及复极化平台期由于通道快速进入失活状态而使电流幅值很小，而在快速复极化期，通道从失活状态恢复而产生较大的电流，使动作电位快速复极。因此herg通道的动力学特性决定其在心肌细胞复极过程中发挥重要作用，herg通道电流的改变将对心肌细胞动作电位时程及ecg的qt间期产生重要影响[11]。

本研究显示，herg wt通道在去极化至-50mv开始激活，超过-10mv则出现明显的内向整流性，复极化到某一电位时，通道重新开放。其这一过程可用一简单模型c→o→i→o来表示[12]，c表示关闭状态，o表示开放状态，i表示失活状态。当处于钳制电位时，通道处于关闭状态，随着去极化刺激电压的增大，通道由关闭进入开放状态，同时迅速失活。在超过-10mv时，由于激活缓慢，而失活较快，使外向电流减小而出现内向整流性。

herg mt通道外口侧g628c和s631c突变氨基酸的电荷特性没有发生改变，但突变使通道的c型失活消失，从而通道的内向整流特性消失。普罗帕酮对herg mt通道ic50比对herg wt通道要大，即普罗帕酮与herg mt通道的结合能力较herg wt通道降低 。这与以前报道的e-4031对herg wt和herg mt的作用一致[6]。普罗帕酮对herg mt的结合能力较herg wt弱，可能是由于氨基酸的改变增强了药物与通道之间的静电排斥，或者氨基酸的改变使通道外口结构域发生改变，从而改变了药物与通道之间的结合方式[13]。

同时本实验也证明普罗帕酮是herg wt和herg mt通道开放状态抑制剂，其具有开放状态通道抑制剂的典型特征，在低于-50mv时普罗帕酮对通道电流没有明显的抑制作用，当去极化至-50mv时或更正的电位时，随着去极电压的增大，药物对通道电流的抑制增大，也就是说通道开放程度越大，药物对通道的抑制作用越强。这和其它通道开放状态抑制剂相似[14]。

总之，我们的研究显示，普罗帕酮是herg通道的开放通道抑制剂，同野生型通道相比，g628c和s631c突变，消除了通道的c型失活，改变了药物与通道之间的结合力。上述结果为herg通道突变导致qt间期延长和心律失常方面提供了分子理论依据。

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　　［5］sanguinetti mc, jiang c, curran me.a mechanistic link between an inherited and an acquired cardiac arrhythmia: herg encodes the ikr potassium channel［j］.cell，1995，81(2):299-307.

　　［6］wang s, morales mj, liu s,et tion of herg affinity for e-4031 by[k+]o and c-type inactivation［j］.febs lett，1997，417(1):43-47.