外膜囊泡医学应用研究进展

摘    要：

外膜囊泡(OMV)是细菌自然生长的产物，呈球形双层膜纳米结构，其表面包含众多PAMPs，与免疫应答相关。OMV具有免疫原性和固有佐剂活性，因此可作为疫苗或单独的疫苗佐剂使用。OMV的中空结构可以作为药物储存载体，同时利用其外部结构实现药物的靶向作用。OMV在医学领域研究甚广，但要充分发挥其功能须清楚了解其研究进展和作用机制。本文通过对OMV在医学方面的应用进行简要综述，以便研究者快速获得此领域进展信息。

 

关键词：

外膜囊泡 疫苗 佐剂 载体 肿瘤 应用

 

The research progress of outer membrane vesicles

LI Sun QI Yuantong GOU Qiang ZHANG Weijun ZUO Qianfei ZOU Quanming

Department of Medical Services,the 968thHospital of PLA; Department of Pharmacy,Army Medical University; Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy,Army Medical University;

Abstract：

Outer membrane vesicle(OMV), a natural growth product of bacteria, is a spherical double-layered nanostructure with a surface containing numerous PAMPs, and associates the immune responses. OMV has immunogenicity and intrinsic adjuvant activity, thus can be used as vaccine and adjuvant. The hollow structure of OMV can be used as a drug storage and transport carrier, and its external structure can be used to achieve drug targeting. OMV has been widely studied in the field of medicine, and it is necessary to understand its research progress and mechanism of action. In this paper, the medical application of OMV is briefly reviewed, so that researchers in this field can quickly obtain progress information.

 

Keyword：

Outer membrane vesicle; Vaccine; Adjuvant; Carrier; Cancer; Application;

 

外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMV）是由细菌外膜衍生而来的球形纳米结构，为细菌正常生长的分泌物，研究证实OMV在微生物与宿主相互作用中发挥着重要作用[1]。OMV通过多种方式影响细菌与宿主状态，包括生物膜形成、营养吸收、调节宿主免疫、细菌通信和毒素释放等[2～3]。OMV为球形双层膜状结构，大小不一，粒径介于20～300 nm之间[4]。其外层为磷脂双分子层，其上包含LPS、外膜蛋白和受体等。OMV内含有大量的周质蛋白、酶和核酸等[3]。关于OMV的形成机制，有多种推论，包括磷脂的积累、膜曲率的增加以及脂蛋白和肽聚糖交联率降低等[3,5-6]。研究发现，在营养不充分、压力改变或受化学刺激后，OMV产量会增加，这说明OMV的形成是一种膜应激反应，其存在可促进细菌存活。此外，OMV已被证明是运输细菌毒力因子和其他物质进入宿主的天然载体[7-10]。

 

研究表明，OMV可激活宿主免疫系统从而调控免疫反应[11]，可作为靶向给药载体和疫苗载体使用[12]，还具有固有疫苗佐剂活性[13]。关于OMV的研究越来越多，OMV在医学研究领域显示出巨大的研究潜力，刘畅等人已从其结构、机制方面对OMV进行过综述[14]，本文将主要从OMV的医学方面应用对OMV研究进展进行简要综述。

 

1 OMV疫苗

传统疫苗多为灭活疫苗或减毒活疫苗，具有潜在的感染风险[15]，研究更安全的疫苗是疫苗研究的重要方向。OMV是一种很有前途的候选疫苗，因为它同时具备抗原性和佐剂特性[16]，具有与活菌相似的免疫诱导能力[17]。OMV可通过其表面的PAMPs激活固有免疫和适应性免疫应答[18]，可促进IL-6、IL-8的产生，促进炎症反应的发生，调节适应性免疫和体液免疫反应[19]。脑膜炎奈瑟菌OMV疫苗已成功上市，并取得较好的保护效果[20]，这便是OMV作为疫苗研究最好的佐证。

 

OMV免疫后，可显著提高抗体表达水平，通过多种途径发挥免疫保护作用。Nakao等人将牙龈链球菌OMV滴鼻免疫小鼠，研究发现它可显著升高血清特异性Ig G、Ig A以及黏膜Ig A表达水平[21]。Liu等人研究发现，肠道沙门氏菌OMV通过鼻内或腹腔免疫小鼠，可激发显著的体液和黏膜免疫反应，并可保护小鼠免受肠道沙门氏菌感染[22]。Liu等人将幽门螺杆菌OMV疫苗于幽门螺杆菌灭活全菌疫苗进行比较发现，OMV免疫可诱导较强的体液和黏膜免疫应答，可显著降低幽门螺杆菌定植量，且OMV主要诱导Th2偏向性免疫反应[23]。Howlader等人制备的抗伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门菌二价OMV疫苗，实验发现该疫苗可诱导显著的体液免疫反应，产生大量的特异性血清Ig G。OMV疫苗通过诱导Th1和Th17介导的免疫应答、限制细菌运动和黏蛋白穿透能力而实现保护性免疫应答，保护宿主免受细菌感染[24]。百日咳疫苗存在储存条件的限制，Kanojia等人构建了一种基于OMV的黏膜型百日咳喷雾疫苗（omv PV），与液体制剂相比，稳定性更好。动物实验发现，omv PV喷雾与omv PV液体制剂表现出等价的免疫反应和抗感染能力，可刺激Ig G和Ig A的产生，激活Th1/Th17免疫应答，此喷雾疫苗保留了液体制剂的免疫保护效果且更佳稳定，具有极大的应用潜力[25]。

 

OMV可促进树突状细胞（DCs）成熟，增强抗原提成作用，激活细胞免疫。DCs在适应性免疫反应中起着重要的作用，血红素氧合酶-1(HO-1）则可调节DCs的功能。Ko等人研究分析，幽门螺旋杆菌的OMV可促进HO-1的表达，从而调节DCs的成熟[26]。

 

OMV还可用于制备病毒疫苗。Martins等人将寨卡病毒（ZIKA）用脑膜炎奈瑟菌OMV包裹制备疫苗，免疫小鼠后，其产生的抗体效价大幅度提高，且加或者不加佐剂均可激活Th1和Th2细胞免疫应答[27]。Bae等人在研究OMV包裹修饰后的LPS对流感病毒感染的作用中证明，细菌外膜囊泡通过募集和激活巨噬细胞而发挥有力的保护作用，可抵抗流感病毒感染[28]。

 

诸多研究均表明，OMV因其结构和成分优势，可同时激活固有免疫和适应性免疫，具有疫苗研究的潜力。

 

2 OMV佐剂

佐剂在疾病的预防和治疗中起着关键的作用，一直是疫苗研究的重点领域。佐剂可影响免疫应答表型，延长免疫反应时间，降低疫苗接种剂量，扩大疫苗适用人群[29-33]，因此佐剂的使用对疫苗效果的发挥至关重要。

 

铝佐剂是首个批准上市的疫苗佐剂[34]，其安全性和有效性已被证实，作为Th2型免疫刺激剂在疫苗中被普遍使用[35]。Th1免疫反应在调控感染方面也发挥着重要作用，但铝佐剂不能诱发Th1应答，且大剂量使用铝佐剂可导致严重的不良反应[36]。Cp G佐剂可激活Th1免疫应答，在动物实验和人体试验均证明其佐剂效果显著，且耐受性好。但是Cp G可促进自身抗体和促炎细胞因子产生，这可能增加宿主对自身免疫性疾病和中毒性休克的易感性。且接种Cp G疫苗会导致更高程度的肿胀、疼痛、红斑等不良反应[37-38]。

 

传统佐剂存在保护率低和潜在副作用等缺点，因此新型佐剂的研发显得至关重要。OMV可激活固有免疫和适应性免疫，且具有佐剂活性，是近几年备受关注的新型疫苗佐剂。

 

早在二十世纪末，便有研究者提出将OMV作为疫苗载体和佐剂使用[39]。OMV被证明可诱导Th1/Th17和Th2混合应答，且可同时激发显著的体液免疫反应[40]。OMV可有效地提应IFN-γ和IL-4的表达，进一步促进Th1偏向应答[41]。在HIV疫苗研究中，研究者使用OMV佐剂可诱导典型的T细胞反应，展现出较好的佐剂活性[42]。

 

综上所述，OMV佐剂具有全面的免疫反应性，且其激活B细胞免疫效果优于铝佐剂，颇具研究价值，有望开发成为新型疫苗佐剂。

 

3 递送载体

研究表明，粒径为10～100 nm的颗粒较容易穿透细胞外基质而进入细胞，达到物质运输的作用[43],OMV因其粒径优势，可作为载体使用。

 

OMV可作为疫苗载体，易被免疫细胞快速内化，并改变细胞因子的分泌，诱发保护性免疫反应[44-46]。Gao等人以金黄色葡萄球菌OMV包裹抗生素具有主动动靶向作用，可将药物运输到细胞内从而消灭胞内金黄色葡萄球菌[47]。Choi等人将OMV作为载体，构建装载s RNA和Mic A的OMV，免疫小鼠后可激发显著的Th1和Th17型免疫应答，保护小鼠免受沙门氏菌感染[48]。Huang等人利用基因工程技术制备表达A.baumannii Omp22的大肠杆菌OMV，免疫小鼠后可产生较高水平的抗原特异性抗体，提高小鼠存活率，且分离出的抗血清具有一定的杀菌活性[49]。

 

OMV可作为药物运输载体使用。传统药物载体可以递送药物，但却不具备靶向作用。Schulz等人利用自然衍生的OMV作为生物相容性固有抗生素载体，实验发现提取的OMV对大肠杆菌生长的抑制作用与庆大霉素相当，这为防止细菌感染提供了新思路[50]。传统抗生素给药存在感染部位浓度低，需多次给药等问题，从而增加了抗生素全身毒性和细菌耐药性。有研究者制备了装载抗生素的OMV，实验发现其可达到局部给药的目的，可显著提高局部药物浓度，降低感染小鼠局部细菌定植量，且安全实验证明其具有良好的生物相容性[51]。

 

OMV作为药物载体研究较多，且越来越多的研究者在逐渐改进方法技术，用于递送不同的药物。基于OMV的诸多特性，如纳米结构、佐剂活性、载药特性等，其作为药物递送载体的优势已逐渐显现。

 

4 肿瘤治疗

肿瘤是死亡率较高的疾病，其治疗是医学领域的难题[52]。目前的治疗多不具备靶向性，这就使得药物治疗效果差而毒副作用明显，不利于患者生存。因此，肿瘤治疗药物的研究着力于其精确的靶向性和治疗的有效性，肿瘤疫苗具备其独特的优势。

 

肿瘤疫苗必须同时满足以下条件才能发挥作用：具有肿瘤或者肿瘤相关抗原，佐剂和递送系统。OMVs具有免疫调节能力，可向宿主细胞提供多种异源抗原，可设计为一种有效的治疗性疫苗，通过基因工程将肿瘤抗原或小分子药物传递给APCs或者靶向癌细胞，从而提高靶向部位的特异性抗体水平以及特异性T细胞应答，保护机体不受肿瘤细胞攻击[53]。

 

Gujrati等利用HER2 OMV与HER2(human epidermal growth factor receptor 2，人表皮生长因子受体2）受体的靶向作用，将si RNA装载于OMV中，靶向至肿瘤区域后释放。动物实验发现，注射此OMV疫苗可导致靶向基因沉默，抑制肿瘤生长的作用，且没有非特异性副作用[54-55]。

 

OMV亦具有抗肿瘤作用，可作为抗肿瘤药物使用。Kim等人的研究表明，注射OMV的小鼠通过干扰素（IFN-γ）介导的抗肿瘤反应抑制肿瘤生长，而IFN-γ分泌不足的小鼠，其抗肿瘤作用大幅下降[56]。

 

OMV还可用作肿瘤药物载体，且研究表明其作用显著。Chen等人将载药胶束用OMV包覆为新型纳米药物，这种药物同时具备OMV激活宿主对癌症的免疫应答调节和载药胶束对肿瘤的化疗作用，使癌细胞对CTL敏感，易于杀死并防止转移[57]。

 

综上所述，OMV在肿瘤治疗领域具有极大的研究潜力，有望成为精准靶向的肿瘤治疗策略。

 

5 优化策略

OMV使用中，仍然有许多问题需要考虑：一是安全性有效性亟待提高；二是需要确保OMV结构完整性；三是保证OMV均一性。

 

通过基因工程对OMV进行修饰是提高其安全性和有效性的重要手段。有研究表明，多抗原同时表达可制备适用范围更广的OMV；工程菌手段还可以提高OMV产量[58]。LPS作为OMV的主要成分，在诱导免疫活性的同时也能降低其安全性，因此制备无/低LPS含量的OMV至关重要。Pulido等人分别以A.baumannii OMV和LPS缺陷的A.baumannii OMV免疫小鼠，实验发现，不含LPS的OMV保护率可达75%，含LPS的OMV保护率可达100%，这说明不含LPS的OMV具有一定的保护作用[59]。Lee等人采用基因敲除技术制备了低LPS的鼠伤寒沙门氏菌OMV，再将其与Omp A融合，免疫小鼠可显著提高血清抗体效价[60]；使用洗涤剂，如脱氧胆酸钠联合EDTA提取的OMV具有低LPS含量的特点，这是最常用的与脱氧胆酸钠联合EDTA；除此之外，通过物理或化学方法提取OMV，可选择性地降低LPS含量[61]。

 

OMV结构的完整性对其发挥作用至关重要。有研究表明，与完整的OMVs相比，EDTA和蛋白酶K处理的OMV不能显著促进促炎因子表达，这表明OMV结构的完整性对炎症反应至关重要[62]。有研究者报道了一种利用氮气快速制备OMV的方法。该方法制备的OMV具有细菌膜的完整性，并含有丰富的膜蛋白，其免疫小鼠后可保护小鼠免受铜绿假单胞菌感染，提高小鼠存活率。此法简单快速，有望成为疫苗制备的新技术[63]。

 

OMV个体差异较大，为保证其均一性，提高免疫效能，Wu等人通过对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的OMV进行修饰，将大小可控的BSA纳米颗粒装入OMV中，从而获得大小均匀、结构稳定的OMV疫苗：BN-OMVs，皮下接种BN-OMVs疫苗可显著提高CRKP特异性抗体滴度，提高小鼠存活率[64]。

 

6 展望

面对细菌感染普遍、抗生素耐药严重等难题，疫苗是预防细菌感染最佳选择。OMV是一种具有潜在应用的疫苗成分，因为它同时具备抗原性和佐剂活性，且因其生物活性物质众多，使得OMV比纯化蛋白、重组蛋白能更有效地激发保护性免疫反应，产生更强的保护作用[16,65]。

 

同时，越来越多的研究表明，OMV在肿瘤治疗领域具有极大的研究潜力，且目前已经有OMV除了在疫苗、药物制剂领域方面被广泛应用之外，其在光学领域具有应用也有报道[66]。

 

综上所述，OMV具有巨大的研究潜力，随着科技进步和研究的深入，OMV的功能逐渐显现，其将在医学领域和其他领域发挥巨大的作用。

 

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