辅助生殖领域中的精准医学

Reproductive Center, Affiliated Maternity Hospital of Nanjing Medical University;

Abstract：

Precision medicine and its advanced technologies have promoted the development of reproductive medicine. The high-throughput sequencing, genome-wide association studies(GWAS), proteomics technology have been successfully used in the etiological diagnosis of infertility, the detection of genetic disease and the pre-implantation genetic testing(PGT) in clinical practice, and the single-celled whole genome amplification(eWGA), biological big data analysis and so on have been also applied in the research of human gamete and early embryo development in recent years. For example, 11 loci and 17 single nucleotide polymorphisms(SNPs) were identified by GWAS, which are strongly correlated with PCOS. When e WGA is applied to PGT, the whole genome information of the egg itself can be deduced by analyzing a single cell obtained from the pre-implantation embryo,so as to reduce the birth with congenital genetic defects and to reduce the iatrogenic risk of assisted reproduction.The artificial intelligence-assisted(AI) method for oocyte or embryo selection during in vitro fertilization-embryo transfer are showing increasing its advantages. This paper reviews the application of precision medicine in assisted reproduction.

 

Keyword：

Precision medicine; Reproductive techniques,assisted; High-throughput nucleotide sequencing; Infertility; Genomics; Artificial intelligence;

 

精准医学是一种将个人基因、环境与生活习惯差异考虑在内的疾病预防与处置的新兴方法，其本质是通过基因组、蛋白质组等组学技术和二代测序等医学前沿技术，对大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益[1]。自2015年初前美国总统奥巴马在美国国情咨文中提出“精准医学计划”以来[2]，精准医学的概念迅速传播普及，已成为未来医学的发展方向，开启了医学发展的新时代。近年来，生殖医学的飞速发展也得益于精准医学概念的普及，高通量测序、全基因组关联研究（genome-wide association studies,GWAS）、生物大数据分析等成功用于不孕不育症的诊断、遗传病检测和胚胎植入前遗传学检测（pre-implantation genetic testing,PGT）等临床实践是目前精准医学临床应用的典范。本文主要对精准医学在辅助生殖领域的应用以及目前得到的一些成果进行综述。

 

1 精准医学与多囊卵巢综合征（PCOS)

PCOS是一种临床表现多样、激素变化不一的生殖内分泌和代谢异常综合征，影响着5%～10%的育龄期女性，临床表现主要包括无排卵或稀发排卵、月经不调、高雄激素血症以及不孕等[3]。早在1935年Stein和Leventhal就提出了这一综合征，但时隔85年，其致病原因尚不清楚，临床表现高度异质，诊断标准、治疗方案均未达到统一[4]。

 

山东大学陈子江团队通过GWAS确定了中国汉族妇女的11个基因座与PCOS有很强的相关性，包括17个单核苷酸多态性（SNPs)[5-6]。随后有外国学者在白种人中验证了这17个位点，确认了其中12个位点存在同样的风险效应，表明这些位点在不同人群中具有类似的遗传效应，但是这些位点出现的概率在不同人群中是不同的[7]。Jones等[8]研究发现，非肥胖PCOS患者STON1-GTF2A1L基因和LHCGR基因表达增加，而肥胖PCOS患者胰岛素受体基因（INSR）的表达下降，表明肥胖PCOS患者和非肥胖PCOS患者之间的基因表达也是不同的。

 

近年来，越来越多的研究发现微小RNA(mi RNA）在PCOS患者的卵泡膜细胞、颗粒细胞、卵泡液等中异常表达，并且影响机体内许多重要的生物过程[9]。Mc Allister等[10]通过小RNA深度测序技术发现PCOS患者卵泡膜细胞中存在18个差异表达的mi RNA，其中，mi R-130b-3p与PCOS患者DENND1A.V2和CYP17A1的表达相关，生物信息学分析显示mi R-130b-3p可能的作用靶点与PCOS患者的高雄激素血症有关。有研究发现mi R-126-5p和mi R-29a-5p表达在PCOS患者中显著降低，其可通过Klotho信号通路影响PCOS患者的颗粒细胞凋亡[11]。mi R-27a-3p在PCOS患者的颗粒细胞中表达显著升高，进一步研究发现其表达异常可能是由于PCOS患者的胰岛素抵抗导致，为研究PCOS患者颗粒细胞功能障碍提供了重要线索[12]。

 

因此，结合最新发现的基因层面的变化以及互联网大数据对我国PCOS表型、症状和诊断策略进行全面综合评价和判定，融入精准医疗的理念，才能在临床上更加精确地做出PCOS的诊断，对不同患病人群给出更加精准的建议，实现个性化治疗。

 

2 精准医学与人类配子/胚胎发育障碍

关于人类配子和早期胚胎发育异常在基因层面的研究一直很少，随着体外受精（IVF）技术和测序技术的发展及其广泛应用，人类配子及早期胚胎发育的过程现在可以更加精准地进行评价和研究。

 

复旦大学王磊团队收集在辅助生殖治疗过程中发现的卵子及早期胚胎发育异常特殊病例，相继发现了卵子成熟障碍的第一个致病基因TUBB8[13]、第二个致病基因PATL2[14]及与人类早期胚胎停育相关的第一个致病基因PADI6[15]。同时，该研究团队先后在4个受精障碍患者家系中发现WEE2基因存在不同的纯合突变，通过进一步研究揭示了WEE2突变的致病机制，WEE2突变通过破坏CDC2及WEE2蛋白自身的磷酸化使得成熟促进因子（maturationpromoting factor,MPF）活性升高，进而导致第二次减数分裂中期（MⅡ）卵子激活障碍，最终引起授精失败[16]。后续对患者卵子成功进行了分子干预，逆转了受精障碍表型，为此类患者未来的基因治疗奠定了基础。最近，该团队对4个在IVF/胞浆内单精子注射（ICSI）受精前后一段时间内出现卵子退化凋亡的病例展开研究，发现糖基化蛋白PANX1相关基因突变，引起PANX1通道异常激活，加速了卵子内部ATP释放，最终导致卵子死亡，并明确“卵子死亡”是一种新的孟德尔显性遗传病[17]。

 

此外，还有学者研究发现确保卵母细胞表观基因组正确建立的核心调控因子SETD2，在卵母细胞中特异性敲除SETD2，卵母细胞中表观遗传修饰的分布情况发生了巨大改变[18]。通过对SETD2的深入研究系统地阐明了表观遗传修饰之间如何通过相互作用建立包括基因印记的卵子表观基因组，及其如何对早期胚胎发育产生至关重要的影响。

 

人类卵子及早期胚胎发育中隐藏着大量前所未知的新基因，在辅助生殖治疗过程中，对那些发育异常的卵子和胚胎在基因层面进一步诊断和治疗，以实现辅助生殖中的精准医学。

 

3 精准医学与男性不育

在全世界约15%的不孕不育夫妇中，有近乎一半是由男性原因导致的[19]。随着遗传学检测技术和组学分析技术的发展，临床上对男性不育的检测和治疗愈发精准高效。当前，对不育症患者基因缺陷方面的检查主要包括染色体分析、Y染色体特定缺陷筛查[如无精子症因子（AZF）缺失]、囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）突变检测、先天性低促性腺激素所致性腺功能减退症相关的基因检测[20]。

 

最近有研究对实时荧光定量聚合酶链反应（q PCR）扩增后的无精症患者精浆外泌体mi RNA做高通量表达谱分析发现，mi R-31-5p、mi R-539-5p和mi R-941可能可以作为预测无精症的标志物[21]。

 

随着蛋白组学技术的发展，对精液和精浆蛋白组学的研究也越来越深入。已经通过组学分析证实精液或精浆中的一些蛋白可以作为无精症的生物标志物，其中PTGDS、ACRV1、ECM1和TEX101已经得到验证和应用[22]。最近有学者对精索静脉曲张的精子线粒体进行蛋白组学分析，确定了22个与精子线粒体结构和功能相关的差异表达蛋白，这些蛋白通过影响线粒体结构和功能可能进一步导致氧化应激，从而影响精子质量。分析这些差异表达标志物将有助于预测精索静脉曲张患者的不育趋势，以及为后续的抗氧化治疗提供靶向路径[23]。

 

4 精准医学在PGT中的应用

以往用于PGT的方法主要有荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）、微阵列比较基因组杂交（microarray-CGH）和SNPs芯片。近年来，随着高通量测序技术、单细胞全基因组扩增（single-cell whole genome amplification,e WGA）及其衍生技术的出现，植入前遗传学诊断不断向高分辨率、高特异性、无创的方向发展，同时分析单基因病和进行全面染色体诊断也成为可能[24]。

 

e WGA是指在单细胞水平对全基因组进行扩增的新技术。应用到PGT中，就可通过分析植入前胚胎中的单个细胞推断出卵子本身的全部基因组信息，从而减少先天性遗传缺陷婴儿的出生，降低辅助生殖的医源性风险。多次退火环状循环扩增技术（MALBAC）是一种全新的e WGA方法，该方法均一性高、等位基因脱扣率低、重现性好[25]。近年来有研究报道通过MALBAC-PGT对1例携带遗传性多囊肾基因（PKD1）患者的胚胎进行基因诊断，筛选出一个不带致病基因的胚胎进行移植，最终获得了一个健康后代[26]。

 

基于高通量测序及MALBAC技术，北京大学谢晓亮团队开发出“高通量测序揭示突变等位基因同时进行染色体异常和连锁分析（MARSALA）”的方法，通过对MALBAC扩增产物进行PCR扩增检测单基因疾病相关的单核苷酸变异（single-nucleotide variant,SNV）、拷贝数变异（copy number variation,CNV）以及非整倍体变异，检测中的假阳性和假阴性可以采用基于高通量测序的连锁分析规避；采用该方法，该团队对一个父方含有常染色体单碱基突变和一个母方含有X染色体单碱基突变的胚胎做精准选择，成功诞生两个没有继承父母单基因疾病的健康婴儿[27]。

 

长读长测序是近年来出现的基于高通量测序的检测方法，其具有超长读长、极低GC偏好性等优势，可以精确检测结构变异、串联重复序列，不过其应用成本相对较高，检测时间也偏长。Miao等[28]通过Nanopore全基因组长读长测序技术，发现了以往短读测序未能捕获到的G6PC等位基因上的7.1 kb杂合缺失，结合短读测序检测到的另一个等位基因上的点突变，鉴定出患者家系常染色体隐性遗传的Ⅰa型糖原贮积病的发病原因和致病基因来源，联合q PCR和微卫星连锁分析筛选出仅携带母源点突变的胚胎进行移植，最后成功分娩一个健康女婴。

 

在精准医疗的发展中，PGT无疑是最为重要的部分之一。技术的进步使得PGT能更精准地筛查出最合适的胚胎移植到母体，提高遗传病家庭生育健康子代的可能。

 

5 辅助生殖领域中的大数据

5.1 辅助生殖与基因组学、转录组学

2003年第一个人类基因组计划的完成敲开了后基因组时代和基因组医学的大门，生殖医学也迅速地进入了后基因组时代的应用领域，我国的基因组分析技术走在世界前列，基因组分析技术已成功应用于对人卵母细胞和早期胚胎发育的研究。北京大学乔杰研究组和汤富酬研究组合作，利用微量细胞甚至单个细胞DNA甲基化高通量测序技术首次解析了人类早期胚胎的DNA甲基化调控网络[29]；后期又揭示了人类早期胚胎DNA去甲基化和从头加甲基化的动态变化、父母本基因组差异甲基化等关键特征，精确绘制了人类植入前胚胎和胎儿生殖细胞发育过程中的转录组、DNA甲基化组图谱[30]。这一系列研究成果对于加深对人类早期胚胎发育表观遗传调控机制的认识、改进辅助生殖技术的安全性评估以及促进临床上早期胚胎发育异常疑难病例的诊治具有非常重要的意义。

 

上海同济大学薛志刚和南京医科大学刘嘉茵等学者利用单细胞RNA测序技术，全面分析了鼠、人类卵母细胞以及早期胚胎不同发育阶段基因转录组的动态变化，发现胚胎早期发育各阶段均存在母源或父源的单等位基因表达差异；胚胎早期发育各阶段关于细胞周期、基因调控、蛋白质翻译以及代谢通路的基因转录变化以逐步启动的方式依序发生，胚胎早期发育由一些阶段特异的关键枢纽基因来驱动[31]。这些研究结果阐明了哺乳动物早期胚胎不同发育阶段转录组表达的特点，对于探讨人类胚胎发育机制、对人类胎源性疾病的临床诊断、预防和治疗均具有重要意义。

 

5.2 大数据用于辅助生殖领域的临床研究

随着互联网时代的到来，医疗和健康数据越来越系统地被收集，并链接生物和基因数据库，产生了具有海量的数据规模、高速的数据流转、多样的数据类型等特征的医学“大数据”。这些大范围的大数据研究具有很高的代表性和统计效能，通过分析和比对这些数据实现生殖医学领域更高效益、更细致、更全面的研究，帮助实现最理想的孕育目标。

 

Yu等[32]从上海市疾控中心出生登记数据库中统计分析了2005—2016年诞生的共2 243 125例活产婴儿，其中6 372例是通过辅助生殖技术诞生的，包括1 363例IVF鲜胚移植、2 012例冻胚IVF移植、1 063例ICSI鲜胚移植和1 934例ICSI冻胚移植，研究发现通过辅助生殖技术尤其是通过ICSI诞生的婴儿，性别为女性的可能性提高，也更有可能是多胎妊娠的产儿；通过辅助生殖技术出生的婴儿面临着更高的出生缺陷风险，但这些风险在冻胚移植和鲜胚移植之间的差异无统计学意义，还需要更大样本的研究来验证。

 

美国杜卡大学的一项研究利用辅助生殖技术注册协会（SART）收集的数据来比较鲜胚移植和冻胚移植临床妊娠率和活产率的差异，该研究分析了82 935例胚胎移植（ET）者的移植周期，其中69 102例患者为首次鲜胚移植、13 833例患者为首次冻胚移植，结果显示在卵巢低反应和中反应人群中鲜胚移植的妊娠率和活产率高于冻胚移植，而卵巢高反应人群的结果却相反[33]。

 

5.3 辅助生殖领域中的人工智能（artificial intelligence,AI)

辅助生殖实验室最重要的工作是预测和鉴定最有活力和发育潜能的卵母细胞或胚胎用于移植，胚胎学家通过视觉检查、利用形态学特征对胚胎进行分级，已被成熟地应用于临床胚胎筛选工作当中，但这种通过形态学评估胚胎的方法具有高度主观性，在整个行业乃至单个中心都没有统一的标准[34]。最近AI提取图像纹理描述符的能力快速提升，在IVF-ET过程中用于卵母细胞或胚胎选择的AI方法已经显示出越来越大的优势[35]。

 

Saeedi等[36]采用自动算法对第5天囊胚特有的生物纹理信息和物理特征进行分析，自动分割出内细胞团（inner cell mass,ICM）和滋养外胚层（trophectoderm,TE）的区域范围。在211枚囊胚中，通过对ICM和TE的自动分割及纹理特征的分析，对TE的识别准确率为86.6%，对ICM识别的准确率为91.3%。

 

Tran等[37]创建了一个名为IVY的深度学习模型（deep learning model），这是一个客观的、完全自动化的系统，其直接从原始的胚胎时差成像数据（timelapse imaging）来预测妊娠，而不需要手动添加任何有关形态发生的注释或囊胚形态评估数据。该研究对来自4个国家8个IVF中心2014年1月—2018年12月10 638个胚胎的第5天囊胚期时差成像数据和临床结局进行回顾性分析，运用IVY预测妊娠真阳性率与假阳性率，其准确率曲线下面积（AUC）为0.93，并且具有高度的可重复性。

 

美国Khosravi等[38]研究实现了基于深层神经网络（DNNs）的AI方法来选择最优质的胚胎，该研究根据Google的初始模型构建一个基于DNNs的STORK框架，对美国康奈尔大学医学院生殖医学中心的10 148枚胚胎超过50 000张时差成像图片识别胚胎质量，准确率达到95%以上，远远优于单个胚胎学家的判断。这种STORK框架是完全自动的，并不需要对输入图像进行任何手动扩充或预处理，更不需要复杂的计算公式，具有很高的普适性。该研究还根据2 082枚胚胎的临床数据构建了一个名叫CHAID的智能决策树，能够通过培养中的胚胎质量结合患者年龄来预测临床妊娠率。

 

6 结语与展望

不孕不育已成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大疾病，生殖健康更是当今世界的重大课题，受到国际社会的广泛关注。明确不孕不育症的病因，提高辅助生殖中筛选胚胎的精准度，开发出具有针对性的精准治疗显得尤其必要和意义重大。辅助生殖的发展已和精准医学的理念密不可分，加快新一代测序技术、大数据分析、人工智能等技术应用于临床，生殖医学必将迎来新的纪元。

 

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