体外诱导骨髓细胞向肥大细胞分化的方法学研究

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine

 

Abstract：

Objective: In order to acquire mast cells and evaluate the activities of the drugs that can regulate mast cell function, we investigate the protocol of inducing the differentiation of mouse bone marrow cells into bone marrow-derived mast cells (BMMC) in vitro. Methods: Bone marrow cells were prepared from mouse femurs and cultured in vitro for 4 weeks under the induction of stem cell factor (SCF), interleukin-3 (IL-3), or combination of SCF and IL-3. Then every week, cell growth was observed and total live cells were counted with an inverted microscope. The percentage of BMMC was analyzed by flow cytometry. After 4 weeks, the releasing capacity of BMMC was evaluated by measuring the release of β-hexosaminidase. Results: All three induction methods can promote the differentiation of BMMC in vitro. Induction with SCF got the lowest purity and number of BMMC. Treatment with IL-3 significantly increased the purity and number of BMMC. Combination of SCF and IL-3 significantly improved the purity of BMMC, and acquired the maximum quantity of BMMC. The BMMC induced by combination of SCF and IL-3 had complete releasing function. Conclusion: This study reveals that combination of SCF and IL-3 has the strongest effect of promoting the differentiation of bone marrow cells into BMMC, which can be used to explore the activities and mechanisms of mast cell function-modulating drugs.

 

Keyword：

bone marrow cells; mast cells; inducing differentiation; flow cytometry; β-hexosaminidase;

 

肥大细胞是引起过敏性疾病的重要效应细胞，过敏反应又称为Ⅰ型变态反应，Ⅰ型变态反应主要是由于患者体内肥大细胞被激活而诱发的。目前认为，肥大细胞驱动的Ⅰ型变态反应主要通过肥大细胞表达IgE高亲和力FcεRⅠ受体，与过敏原特异性IgE抗体结合形成IgE-FcεRⅠ复合物，在过敏原刺激后，肥大细胞被活化导致多种炎症介质和细胞因子的释放，从而引起Ⅰ型变态反应[1,2,3]。因此，获取大量高质量的肥大细胞对进一步研究其在Ⅰ型变态反应疾病进程中的作用及抗过敏药物的药效和作用机制研究具有重要意义。

 

目前过敏反应研究的体外细胞模型大多使用大鼠肿瘤化RBL-2H3细胞株，这种细胞虽然保留了肥大细胞和嗜碱性粒细胞的多种功能，能够用于抗过敏药物的初步筛选，但仍然和原代细胞有很大差异，不能完全满足抗过敏药物药效评价和机制研究的需求[4,5]。体外原代培养的肥大细胞具备更完整的成熟肥大细胞特性，因此获得大量原代培养的肥大细胞对于肥大细胞及抗过敏药物的研究至关重要[6]。然而通过体外诱导培养获取高质量肥大细胞还缺乏系统性的方法学研究，已有的方法学研究缺乏细胞表型和功能鉴定[7,8,9]，这严重制约了抗过敏反应药物的研发进程。本研究将通过体外培养骨髓造血干祖细胞，利用不同细胞因子诱导肥大细胞分化，比较各种诱导方法对肥大细胞分化的影响，初步建立一种高效可行的原代肥大细胞培养方法，从而为肥大细胞功能调节药物药效和作用机制准备高质量的肥大细胞。

 

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠9只，8周龄，购自北京斯贝福生物技术有限公司。动物合格证号，1100112011044776，饲养于北京中医药大学动物房屏障环境中。饲养环境恒温恒湿，室温为24℃ ± 1℃，湿度为50% ± 5%），光照黑暗交替12 h，适应性饲养1周后用于实验。所有动物实验经北京中医药大学动物实验伦理委员会审批后进行。

 

1.1.2 主要试剂

RPMI1640细胞培养液，购自美国Cytiva公司；青霉素和链霉素混合液、胎牛血清，购自美国Corning公司；Hank’s平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution, HBSS)，购自美国ThermoFisher公司；红细胞裂解液，购自北京佰瑞达生物科技有限公司；FITC标记的大鼠抗小鼠CD117抗体、PE标记的大鼠抗小鼠CD49b抗体、APC标记的大鼠抗小鼠FcεRI抗体和7-氨基放线菌素D (7-AAD)死细胞染色液，购自美国BD Biosciences公司；干细胞因子（Stem cell factor, SCF）和白细胞介素-3（Interleukin-3, IL-3），购自美国PeproTech公司；牛血清白蛋白、偶联牛血清白蛋白的二硝基苯（DNP-BSA）、抗DNP的IgE抗体、β-己糖胺酶底物4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖，购自美国Sigma-Aldrich公司；磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)抑制剂U73122和蛋白激酶C (Protein Kinase C, PKC)抑制剂Staurosporine，购自美国Selleck Chemicals公司。

 

1.1.3 主要仪器：

MCO-18AIC二氧化碳细胞培养箱，购自日本三洋公司；DM500倒置显微镜，购自德国Leica公司；FACSCantoTM Ⅱ流式细胞仪,购自美国BD公司；Enspire多功能酶标仪，购自美国PerkinElmer公司。

 

1.2 方法

1.2.1 肥大细胞的诱导培养

颈椎脱臼处死C57BL/6小鼠，75%乙醇水溶液浸泡小鼠全身5 min后，超净台无菌取小鼠股骨骨髓，利用1 mL注射器吸取含10%胎牛血清的RPMI1640培养基将骨髓细胞冲到15 mL无菌离心管中，室温300 g离心5 min，弃去上清；加5 mL红细胞裂解液裂解红细胞，室温300 g离心5 min，弃去上清；加5 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，室温300 g离心5 min，弃去上清；加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，经细胞计数后调整细胞浓度为2×106/mL，然后接种到24孔板，500 μL细胞悬液/孔；设置三种不同刺激孔：细胞因子SCF（终浓度50 ng/mL）孔，细胞因子IL-3（终浓度20 ng/mL）孔以及细胞因子SCF（终浓度50 ng/mL）和IL-3（终浓度20 ng/mL）联合刺激孔，培养基总体积1 mL；将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养4周（4 w），每3.5天半量更新培养基，并重新添加1次细胞因子。

 

1.2.2 细胞生长的倒置显微镜观察

第1 w、2 w、3 w和4 w取上述细胞在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，并进行拍照。

 

1.2.3 细胞计数和传代

第1 w、2 w、3 w和4 w将培养的细胞重悬后，取各孔细胞悬液10 μL与等体积台盼蓝染色液混合后，吸取到细胞计数板上，在倒置显微镜下进行活细胞计数，并根据细胞增殖情况按适当比例传代培养。

 

1.2.4 肥大细胞的流式分析

第1 w、2 w、3 w和4 w将培养的细胞，取各孔部分细胞至2 mL离心管中，4℃、300 g离心5 min后弃上清，并利用200 μL流式染色缓冲液（含0.2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH 7.2）重悬；在各样本中加入FTIC标记大鼠抗小鼠CD117抗体、PE标记大鼠抗小鼠CD49b抗体、APC标记大鼠抗小鼠FcεRI抗体和死细胞染色液7-AAD，终浓度均为1 μg/mL，冰浴染色30 min；加入1 mL流式染色缓冲液清洗细胞，4℃、300 g离心5 min后弃上清，最后加入400 μL流式染色缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面FcεRI和CD117的表达水平。

 

1.2.5 肥大细胞的功能测定

将上述各孔诱导培养4 w的细胞收集至15 mL离心管中，离心去上清，利用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1.5×106 /mL，接种到96孔板中，100 μL/孔，设置对照组、模型组及模型+给药组；将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养，6 h后于模型组及模型+给药组加入抗DNP的IgE抗体，50 μL/孔，其余孔加入等体积含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2孵育过夜；吸弃上清，加入HBSS缓冲液，100 μL/孔；将细胞置于培养箱中孵育10 min，在模型+给药组加入U73122（终浓度1 μmol/L）或Staurosporine（终浓度1 μmol/L），50 μL/孔，其余孔加入等体积HBSS；将细胞置于培养箱中孵育15 min，在模型组及模型+给药组各孔加入50 μL DNP-BSA至终浓度1 μg/mL，将细胞置于培养箱中孵育1 h，取出96孔板，每孔吸50 μL细胞上清至另一96孔板中，向上清中加入4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖（利用pH 4.5的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液配制，浓度为1 mmol/L），50 μL/孔，置于培养箱中孵育1 h后，加入200 μL的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 10.0)终止反应，用酶标仪于405 nm测定OD值。

 

1.3 统计学处理

利用FlowJo 7分析流式细胞检测的源文件，分析活细胞中肥大细胞和嗜碱性粒细胞的比例。定量数据利用平均值±标准差表示，利用GraphPad Prism 5.0进行统计分析，单因素方差分析及后续Dunnett检验进行数据之间的比较，以P < 0.05时认为差异有统计学意义。

 

2. 结果

2.1细胞生长状态

倒置显微镜下观察发现，体外培养3天时，开始铺板的部分细胞死亡碎片化，SCF刺激孔仅剩余少量细胞，IL-3单独刺激孔、SCF和IL-3联合刺激孔有明显的细胞增殖；1 w时，SCF刺激孔细胞有少量增殖，IL-3单独刺激孔、SCF和IL-3联合刺激孔出现较快的细胞增殖；2 w时，SCF刺激孔细胞仍然有少量增殖，IL-3单独刺激孔、SCF和IL-3联合刺激孔细胞增殖很快，体积较大的增殖期细胞较多；3 w时，SCF刺激孔细胞基本上停止增殖，IL-3单独刺激孔、SCF和IL-3联合刺激孔细胞增殖仍然很快，体积较大的增殖期细胞较多；4 w时，SCF刺激孔细胞明显减少，细胞碎片增多，IL-3单独刺激孔、SCF和IL-3联合刺激孔细胞增殖仍然很快，但是SCF和IL-3联合刺激孔细胞相对IL-3单独刺激孔增殖期细胞比例更高（图1）。

 

2.2活细胞计数

根据细胞计数结果和传代数量及比例，统计培养不同时间后各刺激组的细胞总数，结果显示不同细胞因子处理孔的细胞增殖情况存在较大差异，SCF刺激孔细胞增殖速度最慢，SCF和IL-3联合刺激孔细胞增殖速度最快。体外培养2 w后，IL-3刺激孔细胞数量相对SCF单独刺激孔显著增加（P < 0.05）；体外培养1 w后SCF和IL-3联合刺激孔的细胞数量相较于SCF刺激孔和IL-3刺激孔显著增加（P < 0.05）（图2）。

 

2.3肥大细胞分化

骨髓细胞培养的第1 w、2 w、3 w和4 w，收集经过各种诱导条件处理的细胞进行流式细胞分析，通过流式分析软件FlowJo分析7-AAD-细胞中CD117和FcεRI的表达。结果显示随着诱导时间增长，SCF刺激孔、IL-3刺激孔、SCF和IL-3联合刺激孔中7-AAD-CD117+ FcεRI+肥大细胞在7-AAD-细胞中比例也逐渐增大。从细胞培养4 w流式图可以发现，SCF单独刺激孔和IL-3单独刺激孔仍然具有明显分群的杂细胞，SCF和IL-3联合刺激孔中主要是单一细胞群，虽然根据统一的设门标准，肥大细胞比例只有52%左右，其它细胞可能是幼稚期肥大细胞（图3A）。

 

根据各种刺激孔中活细胞总数和7-AAD- CD117+ FcεRI+肥大细胞比例，计算各孔中肥大细胞总数。结果显示三种诱导条件均可使肥大细胞比例及其总数上升，IL-3单独刺激孔中肥大细胞比例最高（P < 0.05），SCF和IL-3联合孔中肥大细胞总数显著高于SCF单独刺激孔和IL-3单独刺激孔（P < 0.05）(图3B和C)。

 

2.4嗜碱性粒细胞分化

在分析肥大细胞分化的同时，本研究也分析了嗜碱性粒细胞的分化，通过分析7-AAD-细胞中CD49b和FcεRI的表达，分析不同诱导条件下7-AAD- CD49b+ FcεRI+嗜碱性粒细胞在7-AAD-细胞中的比例。结果显示SCF刺激孔中嗜碱性粒细胞比例一直非常低；IL-3刺激孔中嗜碱性粒细胞比例最高，但是随着诱导时间增长，嗜碱性粒细胞比例不断下降；SCF和IL-3联合刺激孔中，同样是初期有一定比例嗜碱性粒细胞，但随着时间增长比例逐渐减小（图4A）。

 

根据各种诱导条件刺激孔中活细胞总数和7-AAD- CD49b+ FcεRI+嗜碱性粒细胞比例，计算各孔中嗜碱性粒细胞总数。结果显示在三种不同诱导条件下的嗜碱性粒细胞比例及其总数有显著差异，IL-3刺激孔中嗜碱性粒细胞比例从1 w起即显著高于SCF刺激孔以及SCF和IL-3联合刺激孔（P < 0.05）；SCF和IL-3联合刺激孔中嗜碱性粒细胞比例一开始显著高于SCF刺激孔（P < 0.05），但4 w后嗜碱性粒细胞比例降低，相对SCF刺激孔无显著性差异。IL-3刺激孔中嗜碱性粒细胞总数从1 w起显著高于SCF刺激孔（P < 0.05）；SCF和IL-3联合刺激孔中嗜碱性粒细胞总数从1 w起即显著高于SCF刺激孔，从2 w起显著高于IL-3刺激孔（P < 0.05）(图4B和C)。

 

2.5 肥大细胞的释放功能

根据上述流式分析，经诱导培养4 w，SCF和IL-3联合刺激孔中细胞主要为肥大细胞，收集该细胞，利用抗DNP的IgE抗体致敏肥大细胞，然后加入DNP-BSA刺激肥大细胞释放颗粒，通过测定β-己糖胺酶释放量评价肥大细胞释放功能。结果显示诱导培养4 w后，SCF和IL-3联合刺激孔中肥大细胞在经过抗DNP的IgE抗体致敏和DNP-BSA刺激后β-己糖胺酶释放量较对照组显著升高（P < 0.05）。

 

另外本研究同时分析了肥大细胞活化和颗粒释放中需要的PLC和PKC抑制剂对其释放β-己糖胺酶的调节作用。结果显示PLC的抑制剂U73122和PKC的抑制剂Staurosporine处理组相对模型组均能显著抑制β-己糖胺酶释放（P < 0.05）（图5）。

 

3. 讨论

SCF及其受体c-Kit在造血干细胞和祖细胞发育中发挥重要作用，其中对肥大细胞发育发挥不可替代的作用，SCF或c-Kit的基因突变都会导致肥大细胞大幅度减少，皮下注射外源SCF则会导致注射部位肥大细胞大幅度增加[10,11,12]。IL-3同样对早期造血祖细胞和一些晚期祖细胞发育发挥重要作用，体内注射IL-3能够导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞的显著增加[13]。目前常用的肥大细胞原代培养方法有SCF/IL-3单独诱导培养以及SCF和IL-3联合诱导培养，肥大细胞的原代培养方法尚无确定的标准[14,15,16,17,18]，因此本研究比较了不同诱导方式对肥大细胞分化的影响，确定肥大细胞诱导培养的最适宜方法和时间，以初步建立一种高效可行的原代肥大细胞培养方法。

 

研究结果显示SCF单独诱导能增加肥大细胞分化，提升肥大细胞的比例，但对肥大细胞分化过程中细胞增殖促进作用较弱，获得的肥大细胞总数较少，这表明SCF单独诱导可能只能促进晚期肥大细胞祖细胞的增殖和分化，获得的肥大细胞纯度和数量均有限。IL-3单独诱导相较于SCF单独诱导不仅增加肥大细胞分化，提升肥大细胞的比例，同时也促进了肥大细胞分化过程中的细胞增殖，培养4周后获得的肥大细胞总数是SCF单独诱导培养的10倍，这可能是由于IL-3对能够分化为肥大细胞祖细胞的早期造血细胞增殖和分化的促进作用。SCF和IL-3联合诱导相对于SCF单独诱导，肥大细胞的纯度和总数均有显著提高；SCF和IL-3联合诱导相对于IL-3单独诱导培养，肥大细胞纯度有所降低，但是总数是IL-3单独诱导培养的100倍，这表明SCF和IL-3联合诱导能够促进多个层次造血祖细胞增殖和分化为肥大细胞，显著提高获得的肥大细胞质量和数量。虽然SCF和IL-3联合诱导4周获得的肥大细胞中有较多幼稚细胞，但是获得的肥大细胞纯度和数量非常可观。

 

因为根据报道IL-3能够诱导嗜碱性粒细胞的产生[13]，本研究还同时分析了嗜碱性粒细胞的分化。结果表明SCF单独诱导不能增加嗜碱性粒细胞的比例和总数。IL-3单独诱导可以较强地促进骨髓细胞向嗜碱性粒细胞分化，嗜碱性粒细胞比例最高的时间在诱导后第1周。随着体外培养时间的延长，嗜碱性粒细胞比例不断下降，总数增加幅度也非常有限。这可能是由于IL-3只能促进晚期造血祖细胞分化为嗜碱性粒细胞，同时嗜碱性粒细胞存活时间较短。SCF和IL-3联合诱导各个时间点嗜碱性粒细胞比例均低于IL-3单独诱导，SCF和IL-3联合诱导的嗜碱性粒细胞总数在第2周后高于IL-3单独诱导，但是数量远低于肥大细胞。因此，SCF和IL-3联合诱导骨髓细胞4周可以获得大量高纯度的肥大细胞。

 

在获得大量高纯度肥大细胞后，本研究进一步利用抗DNP的IgE抗体致敏和DNP-BSA刺激肥大细胞脱颗粒反应，通过检测释放的β-己糖胺酶活性来评价肥大细胞的功能[14,15]。结果表明SCF和IL-3联合诱导骨髓细胞4周获得的肥大细胞，经过抗DNP的IgE抗体致敏和DNP-BSA刺激后，β-己糖胺酶释放量较对照组显著升高。这表明，SCF和IL-3联合诱导培养4周的肥大细胞具有完整的功能。另外本研究分析了PLC的抑制剂U73122和PKC的抑制剂Staurosporine对肥大细胞β-己糖胺酶释放的调节作用，结果显示两种阳性抑制剂均能显著抑制肥大细胞释放β-己糖胺酶。这表明，经过SCF和IL-3联合诱导培养4周的肥大细胞可以用于抗过敏药物的药效和作用机制研究。

 

综上所述，本研究发现SCF和IL-3联合诱导骨髓细胞4周能够获得大量高纯度且功能完整的肥大细胞，可以用于后续通过调节肥大细胞功能发挥抗过敏作用药物的药效和作用机制研究。

 

参考文献

[1] GALLI S J, TSAI M, PILIPONSKY A M. The development of allergic inflammation [J]. Nature, 2008, 454(7203): 445-454.

[2] CARDAMONE C, PARENTE R, FEO G D, et al. Mast cells as effector cells of innate immunity and regulators of adaptive immunity [J]. Immunology Letters, 2016, 178: 10-14.

[3] KUBO M. Mast cells and basophils in allergic inflammation [J]. Current Opinion in Immunology, 2018, 54: 74-79.

[4] 郝瑞瑞，庞菲，靳洪涛. 过敏性疾病体内外模型构建研究进展 [J]. 中国比较医学杂志, 2021, 31(07): 125-134.

[5] SUGAYA K, TERAJIMA T, TAKAHASHI A, et al. Bisorbicillinol inhibits Lyn tyrosine kinase for allergic response on RBL-2H3 cells [J] Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2019, 29(6): 832-835.

[6] 孙星, 傅继华. 过敏性疾病药物治疗研究现状及进展 [J]. 中国医药指南, 2011, 9(09): 194-196.

[7] HAIG D M, HUNTLEY J F, MACKELLAR A, et al. Effects of stem cell factor (Kit-Liand) and interleukin-3 on the growth and serine proteinase expression of rat bone-marrow-derived or serosal mast cells [J]. Blood, 1994, 83(1): 72-83.

[8] 王春锋, 李济宇. 一种简单经济的小鼠骨髓源性肥大细胞的培养与鉴定 [J]. 中国免疫学杂志, 2011, 27(10): 910-921.

[9] 石任任, 王珊, 何颖, 等. 小鼠骨髓来源肥大细胞的诱导培养及功能鉴定 [J]. 东南大学学报, 2015, 34(5): 684-688.

[10] CHABOT B, STEPHENSON D A., CHAPMAN V M, et al. The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine kinase receptor maps to the mouse W locus [J]. Nature, 1988, 335: 88-89.

[11] COPELAND N G, GILBERT D J, CHO BC, et al. Mast cell growth factor maps near the steel locus on mouse chromosome 10 and is deleted in a number of steel alleles [J]. Cell, 1990, 63(1): 175-183.

[12] OKAYAMA Y, KAWAKAMI T. Development, migration, and survival of mast cells [J]. Immunol Res, 2006, 34(2): 97-115.

[13] OH K, SHEN T, GROS G L, et al. Induction of Th2 type immunity in a mouse system reveals a novel immunoregulatory role of basophils [J]. Blood, 2007, 109(7): 2921-2927.

[14] NAM S T, PARK Y H, KIM H W, et al. Suppression of IgE-mediated mast cell activation and mouse anaphylaxis via inhibition of Syk activation by 8-formyl-7-hydroxy-4-methylcoumarin, 4μ8C [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2017, 332: 25-31.

[15] PAYNE S G, OSKERITZIAN C A, GRIFFITHS R, et al. The immunosuppressant drug FTY720 inhibits cytosolic phospholipase A2 independently of sphingosine-1-phosphate receptors [J]. Blood, 2007, 109(3): 1077-1085.

[16] NAKAE S, LIKURA M, SUTO H, et al. TIM-1 and TIM-3 enhancement of Th2 cytokine production by mast cells [J]. Blood, 2007, 110(7): 2565-2568.

[17] GILCHRIST M, HENDERSON W R, MOROTTI A, et al. A key role for ATF3 in regulating mast cell survival and mediator release [J]. Blood, 2010, 115(23): 4734-4741.

[18] NAKANO N, NISHIYAMA C, KANADA S, et al. Involvement of mast cells in IL-12/23 p40 production is essential for survival from polymicrobial infections [J]. Blood, 2007, 109(11): 4846-4855.

本文链接：http://www.qk112.com/lwfw/yxlw/qitayixue/127196.html