隐丹参酮对淋巴细胞增殖反应的影响

作者：张雷，郑芙林，李珊珊，贾晓益，魏伟

【摘要】 目的了解隐丹参酮对正常sd大鼠和胶原性关节炎大鼠细胞免疫功能的影响。方法采用鸡ii型胶原诱导大鼠胶原性关节炎模型，采用mtt法检测lps诱导的脾脏b淋巴细胞、cona刺激的胸腺t淋巴细胞增殖反应。结果隐丹参酮体外用药，低浓度时对正常sd大鼠的淋巴细胞增殖反应具有促进作用，随着浓度的升高开始出现抑制作用；隐丹参酮低浓度时对胶原性关节炎大鼠cona诱导的胸腺细胞低下的免疫功能具有增强作用，高浓度时对lps诱导的脾细胞亢进的免疫功能具有抑制作用。结论隐丹参酮对正常大鼠的免疫功能具有浓度和机能依赖性的双向免疫调节作用，对胶原性关节炎大鼠异常的免疫功能具有一定的改善作用。

【关键词】 隐丹参酮；淋巴细胞；胶原性关节炎；大鼠

隐丹参酮(cryptotanshinone， ct)是从中药丹参中提取的单体化合物，有明确的化学结构（c19h20o3，mw 296.35）。丹参作为一种传统中药在我国沿用已久，具有祛瘀止痛、活血通经、清经除烦的功效，主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调等症。研究表明， 隐丹参酮对角叉菜胶引起的大鼠足跖肿胀、对蛋清引起的大鼠急性关节肿等均有明显的抑制作用。本文主要观察了ct对正常sd大鼠和胶原性关节炎(collageninduced arthritis， cia)大鼠胸腺t淋巴细胞、脾脏b淋巴细胞增殖反应的影响。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物雄性spraguedawley (sd)大鼠，体质量（160±20）g，安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准第01号。

　　1.2 药物与试剂隐丹参酮(ct)，批号：050428，由中山大学药学院提供；卡介苗，每支50mg，上海生物制品所生产；鸡ii型胶原(cii)，上海本草生物医学研究所产品；dmem培养粉，美国gibco公司产品；刀豆蛋白a (concanavalin a， con a) 、脂多糖( lipopolysaccharide，lps)：美国sigma公司产品；二甲亚砜（dmso，分析纯），天津市光复精细化工研究所产品；溴化3（4，5二甲基噻唑2）2，5二甲苯基四氮唑（四甲基偶氮唑蓝，mtt），美国sigma公司产品。

　　1.3 仪器napco6100型co2培养箱（美国杜邦公司产品）；gl20a全自动高速冷冻离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）；el301 strip reader（美国biotek公司）。

　　2 方法

　　2.1 药物的配制ct先用无水乙醇溶解，再用无血清的dmem培养液配制所需的5个浓度。刀豆素a（cona），脂多糖（lps）分别用无血清的dmem培养液配制。

　　2.2 大鼠cia模型的建立［1］将cⅱ溶于0.1 mol·l1醋酸中，在4 ℃下搅拌使之充分溶解，质量浓度为2g·l-1，置4 ℃冰箱过夜，再将灭活的卡介苗置于液体石蜡中，配成0.5 g·l-1的完全弗氏佐剂，将二者等体积混合、乳化，制成cⅱ乳剂。将该乳剂于大鼠的右后足趾皮内注射0.1 ml致炎，第7天尾根部近1/3处和背部3～5点皮内注射该乳剂0.1 ml作为激发注射。

　　2.3 胸腺t淋巴细胞，脾脏b淋巴细胞增殖功能测定（mtt法）［2］分别取正常大鼠和致炎后35d cia大鼠，无菌取胸腺和脾制成淋巴细胞悬液，调整细胞至终浓度为1×107/ml，dmem培养液培养细胞，在96孔培养板上每孔加入100 μl细胞悬液，50μlcona（终浓度5μg/ml）或lps（终浓度6 μg/ml），50 μl不同浓度的ct（0.1，1，10，100，1 000 μg/ml）培养48 h，终止培养前4h加入20 μl mtt (5 mg/ml)，继续培养4h后加入150 μldmso终止反应，酶标仪检测（490 nm）吸光度(absorbance， a)值，结果以3个复孔a值的均值表示。

　　2.4 统计学处理实验结果以±s表示，组间差异性比较采用spss10.0统计软件计算。

　　3 结果

　　3.1 ct对正常大鼠脾细胞和胸腺细胞增殖影响

　　由表1可知， lps诱导的脾脏b淋巴细胞和cona刺激的胸腺t淋巴细胞增殖较正常对照显著增强，差别有显著意义（p<0.01）；而ct不同浓度对其增殖表现出不同的效应，低浓度时进一步促进其增殖，1μg/ml时对b、t淋巴细胞增殖反应的促进作用均有统计学意义（p<0.05）。随着浓度的增高，出现抑制作用，100，1 000 μg/ml剂量组对lps诱导的b淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，1 000 μg/ml剂量组对cona诱导的t淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，分别与刺激剂诱导的正常组比较，差异有显著意义（p<0.01）。表1 ct体外对正常大鼠cona诱导的胸腺细胞和lps诱导的脾细胞增殖反应的影响（略）

　　3.2 ct对cia大鼠脾细胞和胸腺细胞增殖反应的改善作用

　　由表2中可知，在cia大鼠中lps诱导的脾脏b淋巴细胞增殖反应较正常对照显著增强；cona诱导的胸腺t淋巴细胞增殖反应却较正常对照组明显降低，差别均有显著意义（p<0.01）；而ct不同浓度对其增殖表现出不同的效应，0.1μg/ml时对cia大鼠低下的胸腺t淋巴细胞增殖具有明显的改善作用（p<0.05），而高浓度时（100，1 000 μg/ml）对lps诱导的b淋巴细胞增殖有明显的抑制作用（p<0.01）。表2 ct体外对cia大鼠cona诱导的胸腺细胞和lps诱导的脾细胞增殖反应的影响（略）

　　4 讨论

类风湿关节炎( rheumatoid arthritis， ra)是一种慢性、系统性自身免疫病。ra以关节滑膜炎为主要特征，表现在多种炎性因子的刺激下，关节滑膜细胞类肿瘤样无限增生，对关节软骨、骨造成进行性破坏，最终导致关节畸形和功能障碍。

　　到目前为止，ra的致病原因和发病机制尚不清楚。近年的研究发现ra的免疫应答是一个免疫调节网络,当抗原被提呈后，t细胞激活发生增殖和分化，不同的t细胞亚群及单核细胞分泌不同的细胞因子。这些细胞因子环境、抗原接触情况和人类白细胞抗原基因表型共同调节t细胞的分化、b细胞的成熟和抗体合成、抗原抗体反应以及细胞免疫的独特应答。这些细胞分泌的正性调节细胞因子、炎性介质以及自身抗体使自身组织受到攻击，产生自身免疫［3］。本研究通过体外实验观察到ct低浓度时对正常sd大鼠的淋巴细胞增殖反应具有促进作用，随着浓度的升高开始出现抑制作用，表明ct对正常大鼠的免疫功能具有浓度和机能依赖性的双向免疫调节作用。本研究表明，ct对cia大鼠异常的免疫功能具有一定的改善作用，低浓度时（0.1 μg/ml）对cia大鼠cona诱导的胸腺细胞低下的免疫功能具有增强作用，高浓度时（100，1 000 μg/ml）对lps诱导的脾细胞亢进的免疫功能具有抑制作用。提示ct可能通过改善cia大鼠异常的免疫功能而治疗ra，其进一步的作用和机制有待深入研究。

【参考文献】
1］朱蕾，魏伟，郑咏秋. 白芍总苷对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞的作用及机制［j］.药学学报， 2006， 41 (2) : 166.

　　［2］徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学,第3版［m］. 北京:人民卫生出版社，2002:1426.

　　［3］vander b a ， geusens p ， raus j ， et al . the autoimmune pathogenesis of rheumatiod arthritis : role of autoreactive t cells and new immunotherapies ［j］. semin arthritis rheum，2001，31 (3) : 160.

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