金花茶种子对激素相关性肿瘤体外抑制作用的实

作者：韩立春，史丽颖, 于大永, 唐前, 唐玲, 冯宝民, 王永奇

【摘要】 目的观察金花茶种子不同提取物对激素相关性肿瘤体外抑制作用。方法采用噻唑蓝比色法(mtt)检测金花茶种子不同提取物对人宫颈癌hela s3细胞和人前列腺癌pc3 细胞增殖的影响。结果金花茶种子乙醇提取物、正丁醇部分和水溶部分都显示了较强的抑制人宫颈癌hela s3细胞和人前列腺癌pc3 细胞增殖的作用，其ic50分别为85.88，67.62，55.71 μg/ml和63.06,56.20,68.53 μg/ml，且抑制作用和样品浓度呈量效关系。结论金花茶种子乙醇提取物的正丁醇部分和水溶部分在体外对激素相关性肿瘤具有抑制作用，为其抗癌活性的有效部位。

【关键词】 金花茶; 宫颈癌; 前列腺癌; hela s3细胞; pc3细胞

　　abstract:objectiveto investigate the inhibitive effect of the seeds of camellia chrysantha (hu) tuyama on gonadal hormones dependent tumour in vitro. methodshela s3 cells were cultivated in rpmi 1640 medium containing 10% fetal calf serum, pc3 cells were cultivated in dmem medium containing 10% fetal calf serum. the anti-proliferative effect of the seeds of camellia chrysantha (hu) tuyama on hela s3 cells and pc3 cells were analyzed by mtt assay. resultsetoh extract, buoh fraction and h2o fraction from the etoh extract from the seeds of camellia chrysantha (hu) tuyama could significantly inhibit the proliferation of hela s3 cells and pc3 cells at ic50 concentration of 85.88, 67.62, 55.71 μg/ml and 63.06, 56.20, 68.53 μg/ml, respectively and a dose-dependent relationship between inhibitive ability and sample concentration. conclusionbuoh fraction and h2o fraction from the etoh extract from the seeds of camellia chrysantha (hu) tuyama are effective for anticancer.

　　key words:camellia chrysantha (hu) tuyama; cervical cancer; prostatic cancer; hela s3 cells; pc3 cells

金花茶camellia chrysantha (hu) tuyama系山茶科theaceae山茶属camellia linn.金花茶组section chrysantha chang植物，被列为国家一级、世界二级珍稀保护植物［1］。金花茶不仅有较高的观赏价值，而且具有一定的药用价值和营养价值。其叶和花为壮族民间用药，主要用于治疗咽喉炎、痢疾、高血压病、便血、月经不调［2,3］。金花茶叶是一种含有丰富营养成分的山茶，含有多种微量元素和氨基酸，而咖啡碱含量低［4］。我们在对山茶属植物抗肿瘤活性的研究中发现，金花茶种子的乙醇提取物具有较强的抗肿瘤作用。本研究将通过考察金花茶种子乙醇提取物不同萃取部位对人宫颈癌hela s3细胞和人前列腺癌pc3 细胞增殖的影响，探讨其抗癌活性的有效部位及量效关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 金花茶的提取分离金花茶种子采集于广西南宁，由广西林业科学研究院高级工程师梁盛业鉴定。取金花茶种子100 g，粉碎后用95%乙醇回流提取3次，3 h/次，合并提取液，减压浓缩成浸膏，加适量水分散，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取液分别浓缩至浸膏，得醋酸乙酯部分、正丁醇部分和水溶部分，减压浓缩并真空干燥后得到各部分的浸膏，各浸膏用dmso配成各浓度溶液备用。

　　1.2 细胞系和培养液人宫颈癌hela s3细胞株和人前列腺癌pc3 细胞株从human sciences research resource bank (日本人类科学基金会, 东京, 日本) 获得，hela s3细胞培养于含有10%热灭活小牛血清的rpmi 1640培养液中，pc3细胞培养于含有10%热灭活小牛血清的dmem培养液中，37℃，5% co2，饱和湿度条件下培养。选取对数生长期细胞进行实验。

　　1.3 体外细胞增殖抑制实验噻唑蓝比色法 (mtt) 检测细胞生长情况，将hela s3细胞和pc3 细胞分别种于96孔培养板，每个孔细胞数为5×103，分别培养于rpmi 1640培养液和dmem培养液中，在37℃，5% co2条件下培养24 h。培养24 h后，以pbs冲洗细胞，然后分别加入新的培养液和系列浓度的待测样品。经初步筛选后确定实验组设6个药物浓度组，每组药物的终浓度分别为5，10，20，40，80，160 μg/ml，对照组加入同样浓度的二甲基亚砜（dmso），培养24 h。培养结束前4 h每孔加入20 ml mtt溶液（5 mg/ml），离心，弃上清液，加入200 ml dmso充分溶解结晶物，酶标仪测490 nm处吸光度值。因为吸光度值与培养液中活细胞数成正比，所以通过吸光度值可以计算细胞存活百分率。

　　1.4 统计分析以对照组中细胞存活率为100%，样品组与其相比所得相对值为细胞存活百分率，实验结果以±s表示，采用统计学t检验进行组间比较分析，p< 0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　用浓度分别为5，10，20，40，80，160 μg/ml的金花茶种子的不同提取物处理hela s3细胞和pc3 细胞，观察不同浓度的样品对hela s3细胞和pc3 细胞增殖的影响。结果发现金花茶种子乙醇提取物、正丁醇部分和水溶部分都显示了较强的抑制hela s3细胞和pc3 细胞增殖的作用（见表1），其ic50分别为85.88，67.62，55.71 μg/ml和63.06，56.20，68.53 μg/ml。其中，正丁醇部分和水溶部分的高浓度组（160 μg/ml）对hela s3细胞和pc3 细胞增殖的抑制率均达60%以上，且抑制率随样品浓度的加大而增加（各浓度组与对照组相比差异有统计学意义，p<0.01），呈现出剂量效应关系。 表1 金花茶各提取物对hela s3细胞和pc3细胞增殖的影响（略）

　　3 讨论

我们采用重组人雌（孕）激素受体基因酵母法对金花茶种子乙醇提取物进行了雌（孕）激素活性试验，证明它们都具有明显的雌（孕）激素活性，同时又有较强的抗雌（孕）激素活性，对雌（孕）激素受体具有双向调节作用，是一种非常理想的选择性雌（孕）激素调节剂［5,6］，引发我们对其抗激素相关性肿瘤（gonadal hormones dependent tumour, ghdt）的研究。因为具有雌激素样作用的药物能直接作用于雌激素受体，通过影响激素平衡来抑制某些激素相关性肿瘤。

我们首先考察了金花茶不同植物部位抑制hela s3细胞和pc3 细胞增殖的活性，在金花茶种子乙醇提取物、花蕾乙醇提取物、叶乙醇提物和叶水提取物中，金花茶种子乙醇提取物显示了较强的抑制hela s3细胞和pc3 细胞增殖的活性，为了确定其抗癌活性的有效部位，我们考察了金花茶种子乙醇提取物不同萃取部位对hela s3细胞和pc3 细胞增殖的影响，结果表明金花茶种子乙醇提取物的正丁醇部分和水溶部分具有较强的抑制hela s3细胞和pc3 细胞增殖的活性，初步确定为抗癌活性的有效部位。对有效部位化学成分的定量分析结果表明，正丁醇部分含总皂苷19.08%，总多酚6.92%，总黄酮5.36%，水溶部分含总皂苷17.36%，总多酚5.15%，总黄酮1.66%，其中哪些成分是抗癌活性的物质基础及其作用机理还有待进一步研究。

【参考文献】
　　［1］梁盛业, 陆敏珠.中国金花茶栽培与开发利用［m］.北京: 中国林业出版社, 2005: 1.

　　［2］黄燮才.金花茶开发利用概况及前景预测［j］.中国中医药信息杂志, 1994, 1 (6): 10.

　　［3］王永奇, 吴小娟, 李红冰, 等.药用山茶属植物的研究［j］.大连大学学报, 2006, 27 (4): 47.

　　［4］韦 霄, 蒋水元, 蒋运生, 等.珍稀濒危植物金花茶研究进展［j］.福建林业科技, 2006, 33 (3): 169.

　　［5］吴小娟, 李 剑, 刘 芸,等.重组雌激素受体基金酵母法对山茶子抗骨质疏松活性部位的研究［j］.辽宁中医药杂志,2008,35(7):126.

　　［6］吴小娟, 李 剑,刘 芸,等.重组雌激素受体基金酵母法对山茶子拮抗孕激素作用的研究［j］.时珍国医国药,2008, 19(8):1817.