癌痛消颗粒醇提工艺的正交实验研究

【摘要】 　　目的优化癌痛消颗粒醇提工艺。方法采用正交设计对癌痛消颗粒醇提工艺的提取方法进行优化，以不同工艺所提总浸出物、总黄酮及野黄芩苷质量分数作为综合评价指标。结果最佳工艺为用80%乙醇回流提取3次，每次加80％乙醇10倍/次，回流1.5 h/次。结论该工艺条件作为癌痛消颗粒醇提工艺是合理的。

【关键词】 癌痛消颗粒 总黄酮 野黄芩苷 醇提工艺 正交实验

癌痛消颗粒的处方源于广西中医学院韦艾凌博士十多年的专病特色方癌痛消散，由白花蛇舌草、半枝莲、三棱、乌药、元胡、香附、枳壳、黄芪、党参、甘草等药组成，具有消积化瘀、清热解毒、行气止痛、健脾益气的功效，能明显改善肝癌早中期患者的临床表现如肝区疼痛、腹胀、纳呆、神疲乏力、舌瘀暗脉弦涩以及并发症腹水等，并且还能改善患者的生存质量，显示出了良好的抗癌疗效前景。动物实验研究显示,癌痛消胶囊对小鼠h22移植性肝癌有抑瘤作用，抑制肿瘤生长的机理可能与下调vegf，p53和p21ras基因表达的水平，诱导肝癌细胞凋亡有关［1，2］。为了使该方剂能够较方便的应用于临床，根据各药味所处的地位和药物成分的特性，拟将癌痛消散各味药用合适方法提取后制成颗粒。本实验通过正交实验探讨癌痛消颗粒醇提工艺，以寻找最佳的提取工艺条件。

　 　1 仪器与材料

日本岛津lc-10atvp型高效液相色谱仪，威玛龙色谱工作站；岛津spd-10avp紫外检测器，mettleram100 电子 天平。

甲醇为色谱纯；水为超纯水（自制）；其他试剂为分析纯。

野黄芩苷对照品（110842-200605）及芦丁对照品（760706）均购自 中国 药品生物制品检定所；各药材均购自南宁市医药有限公司，经广西中医学院鉴定教研室韦松基教授鉴定。

　 　2 方法与结果

　　2.1 因素水平的确定根据药物的特性并结合生产实际，醇提工艺选取了对提取影响较大的乙醇浓度、加醇量、回流次数及回流时间作为考察因素，选用l9(34)正交实验表进行重复实验（n=2）。结果见表1。表1 因素与水平（略）
　
　　2.2 指标的确定考虑到复方多成分作用的特点及方中君药成分簇群的生物特性，选择总浸出物、总黄酮及野黄芩苷作为综合评价指标。见表2。

　　2.3 总浸出物的测定［3］将药材适当的粉碎，按处方的比例要求精密称取白花蛇舌草、半枝莲药材共3 g 9份,按正交表1选择的条件回流提取,合并各份提取液，过滤，旋转蒸发回收乙醇，水浴锅上水浴蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器中冷却0.5 h，迅速精密称定重量。浸膏得率(％)=浸膏重/样品重×100％。结果见表2。

　　2.4 总黄酮的测定［3，4］

　　2.4.1 供试品溶液的制备按处方比例精密称取白花蛇舌草、半枝莲等药材共约5.1 g 9份，分别按各组的工艺要求提取后,将提取液浓缩至30 ml,加石油醚30 ml萃取3次,分取水层并蒸干,残渣加甲醇80 ml分多次溶解后过滤,滤液移至100 ml量瓶中,另用甲醇20 ml分数次在分液漏斗中洗涤并过滤残渣,洗液并入量瓶中,加甲醇至刻度，作为供试品溶液。

　　2.4.2 对照品溶液的制备精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇20 ml至水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10 ml，置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每毫升含无水芦丁0.2 mg）。

　　2.4.3 测定精密量取对照品1，2，3，4，5，与6 ml，分别置25 ml量瓶中，加水6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml使混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀放置6 min，加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，照分光光度法，在500 nm的波长处测定收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取样品1.5 ml，置25 ml量瓶中，照标准曲线制备方法，自“加水6 ml”起依法测定吸收度，从曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量(mg)， 计算 ，即得。结果见表2。

　　2.5 野黄芩苷的测定［5］

　　2.5.1 色谱条件色谱柱为kromasil c18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-3%乙酸（30∶70），柱温为室温，检测波长335 nm，流速1.0 ml/min，进样量10 μl。

　　2.5.2 对照品溶液的制备精密称定野黄芩苷对照品2.61 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇完全溶解并稀释至刻度，摇匀，备用（每毫升中含野黄芩苷0.104 4 mg）。

　　2.5.3 供试品溶液的制备 取“2.4.1”项下样品，以微孔滤膜过滤，为供试品。

　　2.5.4 测定精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μl，注入hplc色谱仪，记录峰面积，按外标法 计算 野黄芩苷的量。结果见表2。表2 样品中各指标的测定结果（略）
　
　　2.6 公式评分在正交实验结果的总体评价中，以野黄芩苷含量和总黄酮含量为主 (各占 50％和30%)，浸膏得率为辅 (占20％)。再按正交实验分析法中多指标分析的公式法，对结果进行计算得到公式评分值，以此对评价指标进行综合评判及方差分析，最佳提取工艺是 a3b3c3d2 。结果见表3。表3 正交实验结果和分析（略）
　
　　2.7 正交设计实验结果分析按方差分析理论得方差分析结果见表4。表4表明乙醇浓度、乙醇量及回流次数有极显著差异。回流时间没有显著差异。表4 方差分析（略）
　
　　2.8 验证实验为了进一步验证正交实验结果的准确性，以确保提取工艺合理可行，按上述工艺条件a3b3c3d2，重复安排3批试验。结果见表5。表5 验证实验（略）
　
验证结果表明，按水提工艺a3b3c3d2所提得的浸膏得率、总黄酮含量以及野黄芩苷含量都接近正交实验中的最大值，表明此工艺稳定，具有重复性和可操作性。

　 　3 讨论

采用正交设计，确定了醇提工艺的最佳条件，即：称取醇提取部分药材，加入10倍量80％乙醇回流提取3次，回流1.5 h/次。 正交结果分析， 65％乙醇和 80％乙醇的提取结果已相当接近，但使用65％乙醇提取浸膏得率虽高，野黄芩苷和黄酮含量并未无显著提高，而且过滤困难，说明浸膏中无效成分较多，而80％乙醇提取浸膏中野黄芩苷及黄酮含量高、杂质少、操作方便；溶剂量及提取时间对各有效成分提取影响显著,提取时间随着时间增加,有效成分反而减少,故将提取时间定在1.5 h。综合考虑提取条件为：用 10倍量的80％乙醇,回流提取3次,为1.5 h/次。

【 参考 文献 】
　　［1］韦艾凌,唐健.癌痛消胶囊调节小鼠荷h22移植性肝癌细胞vegf表达的实验研究［j］.广西中医药,2004,27(4):47.

　　［2］王庆高, 韦艾凌,徐志新.癌痛消胶囊调节小鼠荷h22移植性肝癌细胞vegf,p53和p21ras表达的实验研究［j］.广西中医药,2005,28(2):45.

　　［3］国家药典委员会.