正交实验法优选盐酸川芎嗪的超声提取工艺

作者：李小燕，关瑜婷，黄安宝，梁秀芳，雷福厚

【摘要】 　　目的优选川芎中盐酸川芎嗪的最佳超声提取工艺。方法采用正交实验法，用高效液相色谱法进行测定，以盐酸川芎嗪为指标，考察溶剂用量、乙醇体积分数、超声时间等因素对川芎提取效果的影响。结果实验设计的3因素中对结果影响最显著的因素为超声时间。盐酸川芎嗪的最佳提取工艺为：5 g川芎粗粉，30%的乙醇（含hcl 0.1 mol·l-1 ）50 ml，超声60 min。最佳条件下盐酸川芎嗪得率为0.560 4 mg/g。结论该法简便、快速、节能、溶剂用量少、提取效率高，适宜于川芎中川芎嗪的提取。

【关键词】 盐酸川芎嗪 川芎 超声波提取工艺 正交实验

　　abstract：objectiveto optimize the ultrasonic extraction process for ligustrazine hydrochloride from ligusticum chuanxiong hort. methodsusing orthogonal design, the effect of solvent consumption ,alcohol volume fraction and ultrasonic time on the extraction results were observed ,with the content of ligustrazine hydrochloride as the index by high performance liquid chromatography．resultsamong the factors of test, the most significant effect was the ultrasonic time. the optimal conditions for the extraction of ligustrazine hydrochloride were as follows: adding 50 ml of 30% alcohol(include 0.1mol·l-1 hcl ) to the herbs(5g),and extracting for 60 minutes by ultrasonic (ultrasonic power was 100 w).the extract yield was 0.5604mg/g .conclusionbecause of its simplicity , rapidness, low solvent consumption and high efficiency of extraction , the method of ultrasonic extraction can be successfully used in extraction for ligustrazine hydrochloride from ligusticum chuanxiong hort..

　　key words：ligustrazine hydrochloride； ligusticum chuanxiong hort； ultrasonic extracting technology； orthogonal test

中药川芎为伞形科植物川芎ligusticum chuanxiong hort的干燥根茎，味辛、微苦、性温，具有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛之功效。川芎嗪( ligustrazine) 又名四甲基吡嗪( tetramethylpyrazine ),是川芎根茎中的主要活性生物碱。 现代 医学表明川芎嗪是一种新型钙离子拮抗剂，具有活血化淤、抗血小板凝集, 扩张血管、改善微循环等作用，临床用于心绞痛、脑血管疾病以及肺动脉高压等呼吸系统疾病的 治疗 ［1～3］ 目前,川芎中川芎嗪等非挥发油成分的提取主要有溶剂浸取回流法和超临界co2 萃取法两种［4～6］，尚未见以盐酸川芎嗪( ligustrazine hydrochloride)为直接提取产物的提取工艺报道。本文运用超声波提取法，以盐酸川芎嗪含量为指标，对川芎的提取工艺进行了正交实验研究，为川芎药材的后续相关研究提供实验依据。

　 　1 材料

　　美国per kin elmer公司series200高效液相色谱仪（包括series 200紫外检测器、series 200二元泵、600 series接口及色谱工作站）； uv-9100紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。盐酸川芎嗪（北京燕京药业有限公司）；川芎饮片（购自南宁市国人大药房，粉碎成粗粉备用）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为高纯水。

　 　2 方法与结果

　　2.1 测定方法的建立

　　2.1.1 紫外分光光度测定方法精密称取0.025 0 g盐酸川芎嗪，置100 ml量瓶中，用水定容至刻度,摇匀，得浓度为0.250 0 mg/ml的盐酸川芎嗪标准贮备液。精密量取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml贮备液，分别置50 ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。以水为空白，在296 nm［7］ 波长下测定吸光度，以盐酸川芎嗪的质量浓度（mg/ml）为横坐标（x），吸光度a为纵坐标（y），制作标准曲线，回归方程为y=40.36x-0.0334，r2=0.999 6 。精密量取川芎药材提取液0.5 ml,置100 ml量瓶中,加水定容至刻度,摇匀，测定吸光度。根据标准曲线 计算 样品溶液的质量浓度，并以此计算每克样品中的提取总量（mg/g）。

　　2.1.2 高效液相色谱检测方法

　　色谱条件：色谱柱为phenomenex gemini c18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；检测波长296 nm；柱温40℃；进样量20 μl；流速1.0 ml/min；流动相为乙腈(a)-水(b)；采用梯度洗脱，程序为：0～10 min a/b(10/90)， 10～20 min a/b(20/80)，20～45 min a/b(55/45)， 45～75 min a/b(80/20)。分别吸取200.00 μg/ml的盐酸川芎嗪标准溶液和提取液各20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。根据峰面积法计算每克样品中的盐酸川芎嗪的含量（mg/g）。色谱图见图1。

　　2.2 超声提取工艺单因素水平的选择采用超声波提取方法，以盐酸乙醇水溶液为溶剂，分别对盐酸浓度、乙醇体积分数、提取溶剂体积、超声时间等提取参数进行实验探讨。
2.2.1 盐酸浓度对提取效果的影响 取5 g样品4份，精密称定，分别置250 ml锥形瓶中，分别加入0.1，0.3，0.5，1.0 mol·l-1的盐酸溶液50 ml，以100 w的超声功率超声60 min，取出冷却并抽滤。按“2.1.1”项下操作，计算每克样品中的提取总量（mg/g）。结果见图2。
　
　　川芎嗪为川芎中的生物碱，而盐酸川芎嗪又具有较好的水溶性，在提取液中加入适量酸不仅有助于川芎嗪的溶出，而且还可降低提取液中醇的用量。实验结果表明，总提取量随盐酸浓度的增加而略有增加,但差异不大。因此提取液中盐酸浓度确定为0.1 mol·l-1。

　　2.2.2 乙醇体积分数对提取效果的影响取5 g样品4份，精密称定，分别置250 ml锥形瓶中，加入含盐酸浓度为0.1 mol·l-1乙醇溶液50 ml，乙醇体积分数分别为20%，40%，60%，80%，超声60 min，取出冷却并抽滤。按“2.1.2”项下操作，计算每克样品中盐酸川芎嗪的含量（mg/g）。结果见图3。
　
实验结果表明，当其他因素固定，开始时超声提取川芎中盐酸川芎嗪的提取效率随着乙醇体积分数升高而升高，达到一定程度以后反而会下降，乙醇的加入有利于盐酸川芎嗪的提取，但乙醇体积分数过高又会阻碍盐酸川芎嗪的溶出。说明不同体积分数的乙醇溶液提取效果不同，故选用40%的乙醇溶液作为提取溶剂。

　　2.2.3 溶剂用量对提取效果的影响取5 g样品4份，精密称定，分别置250 ml锥形瓶中，分别加入40，60，80，100 ml含0.1 mol·l-1盐酸、乙醇体积分数为40% 的盐酸乙醇溶液，超声60 min。取出冷却并抽滤，按“2.1.1”项下操作，计算每克样品中的提取总量（mg/g）。结果见图4。

结果表明，溶剂用量对提取效果和提取成本产生直接影响。提取过程中溶剂用量太小有效成分无法完全溶出，用量过大则会使成本提高。由图4可知，在其他因素固定的情况下，较理想的溶剂体积为50～80 ml。

　　2.2.4 超声时间对提取效果的影响 取5 g样品4份，精密称定，分别置250 ml锥形瓶中，分别加入80 ml含0.1 mol·l-1盐酸、乙醇体积分数为40% 的盐酸乙醇溶液，超声时间分别为30，60，90，120 min。取出冷却并抽滤，按“2.1.1”项下操作， 计算 每克样品中的提取总量（mg/g）。结果见图5。
　
实验结果表明，提取总量随超声时间的增加而逐渐增加，超声60 min后药材提取率增加不大，说明超声时间为60 min左右，提取基本完全。

　　2.3 正交实验方法与结果考虑到各因素之间的相互影响，为了获得最佳工艺条件，利用正交法“均衡搭配”的特点，根据上述单因素实验结果，以溶剂体积、乙醇体积分数和超声提取时间作为考察因素，每个因素取3个水平，选用l9(34)正交表［8］进行实验，使用高效液相色谱法评价提取效果，以川芎中盐酸川芎嗪的含量为考察指标，进行了9次实验， 正交实验结果见表1。表1 正交实验设计与结果（略）
　
根据极差分析可知rc>rb>ra，因此，影响盐酸川芎嗪提取的各因素的主次顺序为c>b>a，即超声时间对提取率影响最大，其次为乙醇体积分数，再次为溶剂体积。各因素最佳水平组合为a1b1c3。即5 g川芎粗粉用50 ml 30%的乙醇（含0.1 mol·l-1盐酸）超声提取60 min。

　　2.4 最佳提取工艺条件的验证按上述确定的最佳工艺条件，进行3次重复实验, 结果显示盐酸川芎嗪得率分别为0.560 2，0.564 2，0.556 9 mg/g，平均得率0.560 4 mg/g，rsd为0.65%。

　　 3 结论

通过单因素和正交实验的结果分析，超声提取川芎中川芎嗪的最佳工艺条件为5 g川芎粗粉,以50 ml含0.1 mol·l-1hcl，乙醇体积分数为30%的盐酸乙醇溶液作为溶剂,超声60 min。盐酸川芎嗪得率为0.560 4 mg/g。

超声提取技术是近年来应用在中草药有效成分提取分离方面的一种新型技术。利用超声波产生的强烈空化效应、强烈振动、热效应、搅拌作用，可以加速药物有效成分进入溶剂， 从而提高提取效率，缩短提取时间,节约溶剂，并且避免了高温对提取成分的破坏。与常规的煎煮法、蒸馏法、溶剂浸提法相比，超声法具有提取温度低、产物生物活性高、溶剂使用量少、操作简便、省时节能等优点。 因此超声波技术在中草药有效成分提取分离的应用研究方面具有重要意义。

【 参考 文献 】
　　［1］胡国芬，王建平.川芎嗪的药理作用及临床应用进展［j］.