农业院校细胞遗传学实验教学体系改革

　　1.前言

　　遗传学是生命科学领域的基础学科之一，是生命科学领域各专业学生所必修的一门重要的专业基础课。遗传学已从孟德尔、摩尔根时代的细胞学水平深入发展到现代的分子水平。现代的遗传学已有三十多个分支，而细胞遗传学作为生物科学中最活跃和最有生命力的学科之一，是农业院校研究生专业基础课的重要组成部分。其实验内容设置水平和建设规模是农业院校校研究生能力培养的重要标志和条件支撑，是农业院研究生教学和学科建设重要的、不可替代的部分。

　　我校细胞遗传学实验室承担着全校农科类各专业农学、植保、园艺、生命科学与技术、葡萄酒、动物科学等6个学院的细胞遗传学实验教学任务。近年来，随着研究生招生规模的不断扩大，对细胞遗传学实验室仪器设备、实验室条件以及实验技术人员的要求也越来越高。特别是分子细胞遗传学日新月异的发展，传统的细胞遗传学实验教学体系已远不能满足研究生科学研究的要求，必须与现代分子遗传学实验技术和最新的科研成果相结合，建立适合农业院校的细胞遗传学实验教学模式，才能真正地提高研究生的实验技能，为科学研究打好基础。本实验室在长期的实验教学过程中，发现研究生细胞遗传学实验教学中存在的问题，并结合农业学院的专业特点以及细胞遗传学实验最基本的目标和功能，通过实验教学改革，建立了结合本专业实际的细胞遗传学实验教学体系，完善了与之相应的研究生细胞遗传学实验室配置和实验材料的建设。

　　2.建立结合专业实际的细胞遗传学实验教学体系

　　2. 1保持细胞遗传学最基本的实验教学内容

　　由于研究生生源专业背景的差异性，尤其是跨专业考取的研究生与本专业考取的研究生相比较，实验技能相差很多。为了帮助专业基础薄弱的研究生尽快掌握遗传学的基本技能，使他们少走弯路，实验室保持了原有的一部分基础实验项目，即植物染色体制片技术、植物染色体结构变异观察、非整倍体观察和鉴定、减数分裂中期I染色体构型观察等实验。特别是染色体制片技术实验，有丝分裂和减数分裂制片都采用黑麦为实验材料，既掌握了植物染色体制片技术同时比较了有丝分裂和减数分裂染色体形态的差异，又使植物染色体组型分析、植物中的超数染色体观察实验穿插其中，使一个实验项目包含了四项实验内容。植物染色体结构变异观察采用目前生产上广泛使用的1B/1R小麦易位系品种为实验材料，利用随体染色体数目的变化来鉴定易位系，既了解了小麦染色体组的组成，又对随体染色体的形态进行了观察。减数分裂中期I染色体构型观察利用各种非整倍体为实验材料，如小麦单体系列、缺体系列、缺四体系列、重双端体系列以及各种远缘杂交后代材料，既观察了各种染色体形态，又用它们作亲本与VE161小麦的杂交后代为材料，观察和鉴定了减数分裂中期I各种多价体染色体构型。

　　2. 2优化细胞遗传学实验的核心技术

　　植物染色体分带技术和植物染色体原位杂交技术既是细胞遗传学实验的核心技术同时由于实验过程长，程序复杂，实验条件要求严格，也是比较难做的实验。为了提高实验质量，使研究生都能掌握这两个实验技术本实验室对其实验步骤进行了优化。植物染色体分带技术采用BSG流程，在45%冰乙酸、5%氢氧化钡和2XSSC溶液中处理温度都采用45°Q既简化了实验流程，又收到了很好的实验效果。植物染色体原位杂交技术采用黑麦代换系、易位系为实验材料，基因组DNA作为探针，利用地高辛标记检测系统，建立了本实验室的原位杂交实验体系。

　　2. 3外源染色体检测的分子标记实验技术的应用

　　近年来，随着分子遗传学的发展，分子标记可直接在DNA分子水平上更加准确、可靠地检测染色体组成，已被广泛用来检测作物外源染色体及染色体片段。随着研究工作的发展，会有越来越多的RFLP、RAPD、SCAR、SSR标记被开发出来，已在外源染色体鉴定和分子标记辅助育种方面发挥巨大作用。所以，本实验室在细胞遗传学实验中开设了外源染色体检测的分子标记实验技术，包括小麦近缘植物基因组特异性PCR标记创建、利用SSR标记鉴定外源染色体、利用DNA分子杂交鉴定外源染色体等实验项目，把最新的实验技术和科研成果应用到细胞遗传学实验内容体系中，为研究生的科研工作打下了良好的基础。

　　2. 4利用蛋白质电泳检测外源染色体的实验技术

　　同工酶在同一部分同源群内的不同染色体之间具有相似性和多态性，他们所携带的多种同工酶基因在染色体上的排列具有一定的次序。在小麦中，利用非整倍体系列（尤其是利用端体和缺体一四体补偿体)和附加系、代换系已经将许多同工酶基因定位于相应的染色体和染色体臂上，并绘制出同工酶基因的染色体图。因此，可以利用同工酶分析检测导入受体中的外源染色体和染色体片段，利用多个生化标记，可进一步确定易位片段的大小和位置。利用种子贮藏蛋白进行外源染色体鉴定是生化标记鉴定的一种有效方法。谷类作物胚乳贮藏蛋白及其亚基在染色体上的分布具有与同工酶相类似的特征，因此也可以用蛋白质谱带特征作标记来鉴定附加系。为此，本实验室设立了同工酶技术在鉴定小麦外源染色体中的应用、利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定外源醇溶蛋白基因、利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定外源HWG基因三个实验项目，从而，建立了完善的细胞学（包括染色体计数、核型分析和染色体分带等）、生化标记(同工酶和蛋白质）、原位杂交和分子标记鉴定外源染色体的细胞遗传学实验体系。

　　3.新的细胞遗传学实验教学体系下的实验室配置

　　3. 1染色体制片仪器设备配置

　　显微镜被广泛应用于各科学研究领域对微观世界的探索具有极其重要的作用。特别是细胞遗传学实验，大部分实验项目都需要显微镜来观察，所以各类显微镜对细胞遗传学实验室都是必需的。除了每人一台普通生物显微镜以外，还需要几种研究用显微镜，常用的研究用显微镜主要有：相衬(差）显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜等。

    3.1.1相衬（差）显微镜

    相衬显微镜（phasecontrastmicroscope)是依靠装在物镜内的相位板，使照射物体点的直射光与衍射光发生干涉，将相位差转换成振幅差（明暗差别)，从而使人们在显微镜下可以观察无色透明的标本。相衬显微镜在细胞遗传学实验室主要用于无染色的染色体标本制作。

　　3.1.2倒置显微镜

　　倒置显微镜（invertedmicroscope)是为了适应植物组织培养、细胞离体培养等显微观察和研究需要而设计的显微镜。由于被检物体均放置在培养皿(或培养瓶）中，就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离较长，以便可以透过较厚的玻璃壁，对培养皿内的被检物体进行显微观察和研究。因此，与一般明场显微镜相比，倒置显微镜的物镜、聚光镜和光源均是颠倒的。

　　3.1.3焚光显微镜

　　劳光显微镜（fluoiescencemicmscope)是利用短波光照射标本，对标本的固有荧光、荧光染色后的二次荧光或免疫荧光进行观察的研究用显微镜。荧光显微镜除具有普通明场显微镜的光学部件外(其中物镜应为专用的荧光物镜)，还应配置有荧光装置。荧光装置的主要部件包括：高压汞灯、激发滤光片、分光镜、吸收激发光滤光片等。荧光显微镜的激发范围主要有：紫外激发、紫色激发、蓝光激发和绿光激发。通过特异的荧光或免疫荧光标记，使特定的染色体或者蛋白质等分子带上特异的荧光素，结合荧光显微镜观察，可以对细胞内特定的分子进行研究，分析它们的分布、动态变化及相互关系。这种观察是其他研究用显微镜很难实现的，也是分子细胞遗传学研究的重要内容。

　　3.2外源染色体的分子标记及蛋白质标记仪器设备配置

　　3.2.1植物总DNA提取设备配置

　　植物总DNA提取的必备的设备有：研钵、液氮罐、电热恒温水浴锅、小容量离心机、大容量离心机、冰箱、制冰机、紫外透射仪、紫外可见分光光度计等。研钵用于研磨植物体的组织以提取植物的DNA或RNA,必须有30套以上。液氮罐用于装运提取DNA磨样时所需的液氮。磨样加提取液后需在65°07水浴温育30分钟左右，同时在配药品时也有不同温度的水浴要求，所以2个室温至100°C水浴锅是必不可少的。当提取少量的DNA时，小容量的离心机是必备的。为提取大量的DNA需一台大容量离心机，一般最大转速均应大于12000mp冰箱和制冰机在这里主要用于DNA提取的冰浴、预冷一些沉淀DNA的溶液及存放DNA必需能满足4C和-20C两个温度要求。另外，由于植物总DNA提取多采用幼苗，所以还需要1台生化培养箱或人工气候箱。

　　3.2.2PCR反应系统设备配置

　　一个实验室要能进行PCR反应实验，一般要具备以下实验设备：超净操作台、旋涡振荡器、小容量离心机和PCR仪。超净操作台还是分子实验室必备的仪器，有不少实验是必须在超净操作台上进行的。在配置PCR混合液及其他溶液时，需用旋涡振荡器进行振荡以便溶液中的各成份充分混匀。PCR仪乃是整个实验室的核心仪器，其种类繁多，性能也有差异，教学实验室应根据自己承担的教学任务选购3台以上。

　　3. 2.3凝胶电泳及显色系统设备配置

　　实验室应具备琼脂糖和聚丙烯酰胺两种凝胶电泳的能力。凝胶电泳系统的主要功能是检测提取的总DNA质量及PCR扩增产物以及蛋白质。整个过程的完成需电泳仪、电泳槽、微波炉、脱色摇床、染胶盆、胶片观察灯、紫外凝胶成像仪和一些常规的小件工具。要检测PCR的扩增产物，需对其进行凝胶电泳及显色反应。因而，电泳仪一般要配备多台，要能满足不同的电泳电压。电泳槽则是电泳仪的配套设备，要根据电泳仪性能和教学实验室承担的教学任务各选购10套以上。微波炉主要用来熔化琼脂糖制胶或培养基配制。脱色摇床和染胶盆是硝酸银染色过程中必备的。胶片观察灯箱有助于观察显色后的胶片以便能更清楚地记录带型，主要观察银染的聚丙烯酰胺胶。琼脂糖胶一般采用溴化乙锭染色，需通过紫外灯观察，所以需要一套凝胶成像系统。要进行Souhem杂交，还得配备杂交箱、恒温培养箱、恒温摇床、凝胶干燥仪等。为了避免同位素污染，应选用生物素标记检测系统、地高辛标记检测系统等。

　　3. 2.4凝胶成像及数据处理系统设备配置

　　这一系统主要包括凝胶成像系统（包括暗箱、紫外换灯箱、灯外灯、数码相机及配套的分析软件等）、扫描仪及各类生物应用软件。图像记录着实验的过程，这也是实验的证据，获得图像这项任务可由凝胶成像系统、扫描仪及配套的软件来完成。实验数据可直接从胶片上读取，也可从已扫描的图像上获得，然后保存在计算机内。常用的分析软件有凝胶成像系统的配套软件、生物统计软件、构建遗传图谱及QTL定位软件、引物设计软件等。生物统计软件目前国际上最为流行的是SAS遗传图谱的构建及QTL分析用得较多的是Mapmaker/Exp30和MapmakeriQTLU设计引物的软件主要有等。

　　3. 2.5其他的常规设备

　　大部分实验用水都要求是超纯水，所以需要一台高质量的纯水器。其次是无菌环境。离心管、Tip头、一些配溶液的器皿以及不少溶液都必需灭菌消毒，因而高压灭菌炉和烘干箱也是分子实验室必不可少的。再者，高精度的电子天平和pH计是配药时必备的仪器，而磁力加热搅拌器则是配药的一个好帮手。教学实验室应有以下几种取样范围的移液器：1000-5000^l100-100020-200Ml10-100Ml2-20Ml0.5-10Ml0.1-2.5M实验室的许多药品都需在低温下保存，需要有良好的冷藏系统，要配备4°C、-20°0的冰箱两台，最好能配有-80°0的超低温冰箱。要有足够的易耗品，如一次性手套，各种Tip头和Tip头盒，离心管及离心管架（这些离心管必须与实验室的离心机和PCR仪相匹配，离心管架要与离心管配套)，玻璃板、梳子、胶条和夹子。

　　4.新的细胞遗传学实验教学体系下的实验材料建设

　　细胞遗传学实验还有一个特殊之处，就是必须有一系列的实验材料作为支撑。本实验室在对实验教学内容改革的同时，扩大了实验材料标本的建设，在保持原有小麦中国春单体系列、缺体系列、缺四体系列、重双端体系列以及各种远缘杂交后代材料的基础上，充分与本领域科研相结合，收集了一大批小麦近缘植物如簇毛麦、滨麦、华山新麦草、大麦、黑麦等的附加系、代换系和易位系材料，为实验的顺利进行提供了保障。