三种细菌培养痰标本预处理方法的策略探讨

[摘要] 目的 在痰标本细菌培养中，对三种痰标本预处理方法进行评价。 方法 收集合格痰标本80份，同时采用三种不同的方法预处理后接种培养基。以直接培养法为对照，比较它们的阳性率差异。 结果 经预处理后接种培养法阳性率均比直接培养法高，差异有统计学意义（P < 0.05）。3种方法间比较阳性率无统计学意义（P > 0.05）。 结论 洗痰碎痰法操作简单，成本低廉，耗时很短，处理后的痰标本几乎没有杂菌干扰，建议在预处理痰标本时推广应用。
　　[关键词] 痰；预处理
　　[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）28-0101-02
　　由于痰液标本留取过程中极易污染上呼吸道定植菌，为尽量减少干扰，在痰培养接种前要对痰标本进行预处理。本文介绍三种痰液标本预处理的方法，并结合实际工作对这些方法的应用进行评价。
　　1 材料与方法
　　收集呼吸科肺部感染患者合格痰标本80份，以直接接种为对照，同时采用以下三种方法预处理后接种平板培养。
　　1.1 生理盐水洗涤法
　　将痰加入含有15～20 mL灭菌生理盐水的试管中，剧烈振荡5～10 s，然后用接种环将沉淀于管底的脓痰小片沾出，再放入另一试管中以同样方法重复两次，最后将余下的脓痰接种在培养基上[1]。
　　1.2 痰均质化法
　　向痰液（洗涤后）标本中加入等量的消化液，分解蛋白使痰液均质化后再接种，主要有如下几种消化液：
　　1.2.1 胰酶溶液 取1∶250胰酶干粉1 g加入100 mL灭菌PBS或生理盐水中，调pH值为7.6即为1%的胰酶应用液。使用时向痰液内加入等量的胰酶应用液，37℃恒温90 min即可使痰液均质化[1]。
　　1.2.2 α-糜蛋白酶溶液 工作原理同胰酶溶液相似。
　　1.2.3 二硫苏糖醇溶液（SPUTASOL消化液）和N-乙酰-L-半胱氨酸溶液 两者均是强还原剂，作用于粘蛋白的二硫键使痰液均质化。
　　1.2.4 H2SO4消化法 仅适用于结核分枝杆菌培养。将痰标本加入等量的4%H2SO4混匀，放35～37℃ 20 min（粘稠标本在放置期间要振荡数次）促使其液化对痰中的杂菌进行处理。然后取出，3000 r/min，5 min离心弃去上清，加BTB指示剂1～2滴，用40 g/L NaOH中和（终点为淡绿色），将其接种于改良罗氏培养基[2]。
　　1.2.5 热处理和酸处理 适用于军团菌分离培养。酸处理液（KCL-HCL）由0.2 mol/L KCL和0.2 mol/L HCL以18∶1比例混合而成，pH=2.2，二者混合后置于玻璃管中加盖高压灭菌待用。取200 μL经SPUTASOL消化液处理后液化的痰液，50℃水浴30 min后再加入等量的酸处理液，放置10～15 min，离心弃上清液，加1 mL双蒸水洗涤1次，离心弃上清液，再加200 μL双蒸水混匀后取50 μL接种军团菌BCYE-DGVPC培养基[3]。
　　1.3 洗痰碎痰法
　　1.3.1 材料准备 ①无菌痰盒；②青霉素小瓶；③纱布；④小玻璃珠；⑤无菌生理盐水。向青霉素小瓶内加入1～2 mL无菌生理盐水和2～3颗小玻璃珠，加盖并用纱布封扎瓶盖，110℃高压灭菌15 s取出备用。
　　1.3.2 操作步骤 无菌痰盒取来合格的痰标本，加入无菌生理盐水洗涤至少3次。洗涤时直接将无菌生理盐水倒入痰盒中，用接种环拉住痰标本来回拖动，如此反复多次便能较彻底地洗去口腔中的定植菌。然后用接种环挑取已洗过三遍的痰标本放入备用的青霉素小瓶内，振摇1～2 min，使块痰变成碎痰，痰内的细菌游离于无菌生理盐水中即可接种平板[4]。
　　1.4 统计学方法
　　以各种预处理方法获得病原菌标本数占各组标本数的百分率分别计算阳性率，各组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　见表1、2。
　　表1 三种方法痰标本预处理后接种培养结果分别与对照组比较
　　3讨论
　　表1、2显示，痰标本不经预处理直接接种培养阳性率最低，与经预处理后接种培养阳性率比较均有显著性差异（P <0.05）。三种预处理方法中，阳性率从高到低顺序排列是洗痰碎痰法、胰酶均质化、生理盐水洗涤法。洗痰碎痰法与胰酶均质化法比较阳性率接近，无显著性差异（P > 0.05）。生理盐水洗涤法与其他两种方法比较，阳性率虽略低，但亦无显著性差异（P > 0.05）。
　　生理盐水洗涤法简便易行，但由于试管面积不够大，洗痰不够彻底，痰在试管内不易摇碎，接种时不一定能得到真正的感染菌或致病菌；另外痰标本多次移动，容易丢失最有价值的部分，操作时需要非常小心。
　　痰均质化法中胰酶溶液是临床实验室最常使用的痰消化液，价廉效果好，对细菌生长几无影响，但消化耗时较长，应用液常温下不易保存（配制后-20℃仅保存10 d），且反复冻融容易失效，临用前配制效果更好。α-糜蛋白酶溶液消化能力更强，消化所需时间更短，但价格昂贵，成本较高。二硫苏糖醇溶液（SPUTASOL消化液）和N-乙酰-L-半胱氨酸溶液方便保存，效期较长，已有配制好的商品试剂出售，但对细菌生长有轻微的抑制作用。柯俊等[5]报道痰标本采用SPUTASOL消化液预处理的时间对流感嗜血杆菌的检出率有较大影响，消化液处理后15 min接种比30 min后接种流感嗜血杆菌的检出率要高。
　　洗痰碎痰法方法操作简单，材料易得，不需要特殊试剂，成本低廉，耗时很短，处理后的标本几乎没有杂菌干扰，建议在细菌室预处理痰标本时推广应用。
　　[参考文献]
　　[1] 叶应妩，王毓三，申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 第3版.南京：东南大学出版社，2006：744-745.
　　[2] 陈东科，孙长贵. 实用临床微生物学检验与图谱[M]. 北京：人民卫生出版社，2011：145-146.
　　[3] 宣瑞红，胡朝晖，王娟，等. 临床标本军团菌分离方法研究[J]. 国际检验医学杂志，2010，31（6）：593-594.
　　[4] 王惠萱，李雪梅，滕毅，等. 临床痰标本检验前期处理新方法研究[J]. 国际检验医学杂志，2010，31（8）：898-899.
　　[5] 柯俊，陈媛，陶治洲，等. 痰标本预处理对细菌学检验结果的影响[J].检验医学与临床，2008，5（13）：814-815.