何首乌对实验性衰老大鼠海马内突触及突触素表

【摘要】  目的 观察何首乌对实验性衰老大鼠海马内突触及突触素表达的影响，以探讨其影响学习记忆的机制。方法 清洁级sd大鼠，皮下注射d-半乳糖(d-gal)建成大鼠衰老模型，用不同浓度的何首乌水煎液灌胃治疗，morris水迷宫检测动物学习记忆能力，采用免疫组织化学染色法、透射电镜技术结合图像分析系统比较各组大鼠海马ca1、ca3区突触素表达和突触体视学变化。结果 与模型组相比，何首乌2、4g/kg能显著降低大鼠水迷宫实验的平均潜伏期，升高跨越平台次数及在ⅳ象限内的游泳时间占整个游泳时间的百分率；亦能显著升高大鼠海马突触的数密度（nv）和面密度（sv）（p均＜0.01）及海马突触素的表达（p<0.01）。结论 何首乌能显著升高实验性衰老大鼠海马内降低的突触素/突触，且可能是增强大鼠学习记忆的机制之一。

【关键词】  何首乌；实验性衰老；海马；突触体视学；突触素

　　衰老的重要表现之一是学习记忆功能减退［1］。何首乌能补肝肾、益精血，长时间服用何首乌的提取物可提高衰老大鼠的学习记忆能力［2，3］，是经典的抗衰老药物之一；对于何首乌抗衰老机制的研究，据报道可能是消除脑组织中自由基的作用、提高海马sod活性等［4］。由于海马是与学习记忆相关的重要脑区，衰老发生时它的结构和功能应激变化较早［5］，因而以海马为切入点研究抗衰老机制具有重要意义。又突触的结构和功能与学习记忆密切联系，突触数密度反映一定参照空间内突触的数目，是揭示参与某一神经活动过程中神经元接点数目的直接指标；突触面密度反映一定参照空间内突触区的总面积，是揭示参与某一神经活动的神经元接点面积的直接指标［6］。且海马内突触素的变化与老年学习记忆减退直接相关［7］。为此，本实验以d-半乳糖致衰老大鼠为研究对象，通过观察何首乌对此大鼠的治疗作用，并检测海马内突触素表达及突触体视学(数密度和面密度)变化，探讨其作用机制，为临床应用于抗衰老的治疗提供科学的依据。

　　1  材料

　　1.1  实验动物  清洁级sd大鼠，雌雄各半，月龄2月左右，体重150~180g，徐州医学院实验动物中心提供，许可证号：syxk（苏）2005-0005，实验前适应性饲养1周。

　　1.2  试剂与仪器  何首乌产自四川（经徐州医学院检验符合药典规定），制成4、2、1g/4ml三种浓度的溶液；d-半乳糖（批号：081016），南京建成生物工程研究所；突触素（p38）免疫组化学试剂盒，millipore公司；morris水迷宫，中国医学科学院药物研究所研制；h-600透射电子显微镜，日本日立公司；laica－200图像分析仪，德国leica microsystems ltd。

　　2  方法

　　2.1  动物分组  60只大鼠随机分为生理盐水（ns）对照组、d-半乳糖模型组（模型组）、何首乌4、2、1mg/kg高、中、低剂量治疗组共五组，每组12只。

　　2.2  建立实验性衰老大鼠模型［8，9］  除ns对照组外，其余各组大鼠（上午8：00）按125mg/(kg·d），均行颈背部sc d-半乳糖，连续60天，ns对照组大鼠除给予等量ns替代d-半乳糖外，其余处理皆同。

　　2.3  药物治疗  实验的第13天（下午16：00）开始，ns对照组和模型组灌注（按4ml/kg）生理盐水；何首乌高、中、低治疗组灌注［按4、2、1g／（4ml·kg）］何首乌溶液；每天1次，连续48天。

　　2.4  morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力  模型建立后，应用morris水迷宫测定大鼠空间学习记忆能力，参考马原野等［10］的方法。(1)定位航行实验(place-navigation)：用60s内寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)表示，反应大鼠的学习能力；(2)空间探索实验(spatial probe)：记录大鼠在2min中内的游泳轨迹，分别计算其跨越ⅳ象限内的游泳时间占整个游泳时间的百分率、跨越平台次数，反应大鼠的空间记忆能力。

　　2.5  电镜样品制备及突触体视学定量分析  经morris水迷宫测试后，每组取6只大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸。以50ml生理盐水经左心室灌注冲净体内血液，再用4%多聚甲醛100ml灌注固定，开颅取脑。参照脑立体定位图谱，取海马ca1、ca3区组织经戊二醛、锇酸双固定，环氧树脂618包埋、超薄切片，铀、铅双染色后透射电镜下观察，电脑左上往右下顺序采集图片12张，放大倍数均为2万，每组测定72张电镜照片。用0.3cm×0.3cm标准测试方格的透明纸覆盖于图片上测算突触的数密度（numerical density ，nv，个/μm3），突触连接带面密度（surface density ，sv，μm2/μm3）。

　　2.6  海马突触素表达  每组剩余6只大鼠同“2.5”灌注固定，取脑，石蜡包埋，并连续冠状切片（厚4μm）。选取海马组织结构完整的切片，每间隔20μm取一，每鼠取6张，按突触素检测试剂盒说明操作，采用亲和素-生物素复合物法进行染色。实验同时设阴性对照，除磷酸缓冲液替代一抗外，其他染色步骤相同。leica  qwin 细胞图像分析系统观察海马突触素免疫反应产物，相同光学条件下在每张切片的ca1区和ca3区随机各取3个视野拍照，ipwin60 软件计算每张照片突触素免疫反应产物的积分光密度值（iod）。

　　2.7  数据统计  所得数据均用spss 16.0 for windows 软件统计处理，多组资料的比较采用单因素方差分析(oneway anova) 进行检验，两组资料的比较，采用两两比较t检验。所有数据用x±s表示。

　　3  结果

　　3.1  morris水迷宫实验结果  由表1数据可见：（1）与ns对照组比较，模型组的平均潜伏期显著升高（p<0.01），而跨越平台次数及在ⅳ象限内的游泳时间占整个游泳时间的百分率均降低（p<0.01）。（2）与模型组比较，何首乌高、中剂量组的平均潜伏期显著降低（p<0.01），跨越平台次数及在ⅳ象限内的游泳时间占整个游泳时间的百分率均升高（p<0.01）；提示何首乌高、中剂量能明显增强实验性衰老大鼠学习记忆能力。表1  各组morris水迷宫实验结果（略）注：与ns对照组比较，★p<0.01，☆p<0.05；与模型组比较，▲p<0.01，△p<0.05

　　3.2  海马内突触素的表达  在ca1和ca3区，镜下可见突触素免疫反应阳性产物呈浅褐色或棕黄色点状、颗粒状沉积成带，ns对照组和治疗组颗粒粗大密集、染色深、反应条带明显，模型组的反应颗粒细小，染色较浅；定量结果显示，模型组与ns对照组比较，突触素的iod值均明显降低（p<0.01）；经何首乌高、中剂量治疗后，该数值显著增高（p<0.01），接近对照组（详见表2，图1）(图略)。

　　3.3  海马突触体视学定量分析  模型组与ns对照组比较，在ca1区突触的nv和sv均显著降低（p＜0.01），在ca3区突触的nv显著降低（p＜0.01）sv降低（p＜0.05）；经何首乌高、中剂量治疗后，nv显著增高（p＜0.01），sv值在ca1区显著增高（p＜0.01）、ca3区增高（p＜0.05），亦接近对照组（详见表3，图2）。表2  各组大鼠ca1和ca3区突触素iod值比较（略）注：与ns对照组比较，★p<0.01，☆p<0.05；与模型组比较：▲p<0.01，△p<0.01表3  各组ca1和ca3区大鼠突触体视学分析结果（略）注：与ns对照组比较，★p<0.01，☆p<0.05；与模型组比较，▲p<0.01，△p<0.05

　　4  讨论

　　d-半乳糖模型已成为国内公认的衰老和脑老化动物模型［8］。在本实验，模型组大鼠平均潜伏期显著升高，而跨越平台次数及在ⅳ象限内的游泳时间占整个游泳时间的百分率均降低，说明此大鼠学习记忆能力明显降低；这与宋士军等［9，10］得出的结果一致。通过何首乌治疗后，上述指标均逆转接近ns对照组，这提示何首乌具有明显改善d-半乳糖所致大鼠学习记忆能力下降的作用。由于对突触素免疫反应产物的定位和定量测定，可反映出被测区域突触的分布和密度，借助图像分析系统测定其iod值，即可在光镜水平对突触素的含量进行粗略的定量分析，进而了解突触数量的变化，实验中模型组大鼠海马突触素免疫反应产物的iod值较生理盐水对照组明显降低，说明在d-半乳糖所致大鼠学习记忆能力下降同时伴有突触素表达的降低，但经何首乌治疗后，iod值有所上升；最值得注意的是，突触素平均iod值的上升与大鼠的学习记忆能力被增强相一致；同时，实验结果提示，突触的数密度和面密度变化与上述结果的进程也是同步的。那么，何首乌是怎样增强d-半乳糖致衰大鼠学习记忆的呢？近年来的研究表明，学习记忆的功能障碍与脑内神经信息传递的关键结构- 突触的变化有关［11］，又突触素是一种与突触结构和功能密切相关的膜蛋白；主要参与突触发生及突触囊泡的导入、转运和神经递质的释放，是突触的分布和密度的特异性标记物［12］；故我们推测，一定浓度的何首乌能增加d-半乳糖致衰大鼠海马神经细胞的数目，促使神经元突触前膜功能也代偿性的改变，使突触素免疫活性增高，进而调节神经元突起延伸以及在中枢神经元建立极性，分化出轴突，轴突在失去靶器官后会出现轴突的出芽和形成许多侧支，并形成新的突触连接，使突触数目、突触连接面增加及突触前囊泡的数量增加，突触素表达升高。这与宿宝贵等［13，14］报道经水迷宫训练获得空间辨别性学习记忆功能的大鼠海马内突触素的表达增强相一致。

　　综上所述，何首乌能显著升高实验性衰老大鼠海马内降低的突触素/突触，可能是其增强大鼠学习记忆的机制之一；本实验结果从形态学角度为临床应用于抗衰老的治疗提供科学的依据。

【参考文献】
  　　1 李怡秋，谭红，李芳芳 等.何首乌对衰老大鼠海马脑源性神经营养因子表达的影响.职业与健康，2008，24(16)：1640-1641.

　　2 chan yc，wang mf，chang hc. polygonum multiflorum extracts improvecognitive performance in senescence accelerated mice. am j chin med，2003，31(2)：171-179.

　　3 chan yc，wang mf，chen yc，et al. long-term administration of poly2gonummultiflorum thunb. reduces cerebral ischemia-induced infarct vol2ume in j chin med，2003，31(1)：71-77.

　　4 王巍，王丹巧. 何首乌脑保护作用机理研究的进展.中国中西医结合杂志，2005，25(10)：955-959.

　　5 blum s，moore an，adams f，et al. amitogen2activated p rotein kinase cascade in the cal/ca2 subfield of the dorsal hippocampus is essential for long2term spatialmemory.j neurosci，1999，19：3535-3544.

　　6 刘薇.医学体视学在小儿神经疾病研究中的应用.脑与神经疾病杂志，2003，11(3)：192-193.

　　7 杨春.突触素的若干研究.河南医学研究，2004，13(1)：85-89.

　　8 楚晋，李林.d-半乳糖致脑老化动物模型及其机理.中国康复理论与实践，2003，18(9)：521-522.

　　9 宋士军，李怡秋，李芳芳，等.实验性衰老大鼠海马和大脑脑源性神经营养因子表达的变化.中国老年学杂志，2008，28(12)：2310-2312.

　　10 马原野，王建红.认知神经科学原理和方法. 重庆： 重庆出版社，2003，250-253.