宫颈癌宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化的治疗

　[摘要] 目的 研究宫颈活检组织DAPK1基因甲基化在宫颈癌中的临床意义。 方法 采用甲基化特异性PCR检测宫颈癌患者和正常女性宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化，比较其差异并分析宫颈癌患者宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化与临床病理因素的关系。 结果 宫颈癌患者宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化率显著高于正常女性（P < 0.05）。宫颈癌患者宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化率在年龄、吸烟史、酗酒史和病理类型无明显差异（P > 0.05），在HPV感染、分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移和Figo分期中的差异具有统计学意义（P < 0.05）。 结论 宫颈癌患者宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化率显著高于正常人，与病情及预后密切相关。
　　[关键词] 宫颈癌；DAPK1；甲基化
　　[中图分类号] R737.33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）35-0016-02
　　研究发现宫颈癌的发生发展与基因表达异常有关，其中基因甲基化导致基因表达下降是目前发现的基因突变外最重要发病机制[1]。死亡相关蛋白激酶1（death-associated protein kinase 1，DAPK1）为新近发现的抑癌基因，在肿瘤的发病机制中扮演重要角色，在多种肿瘤中可检测到其甲基化抑制基因表达状态[2，3]。本研究采用甲基化特异性PCR检测宫颈癌患者和正常人DAPK1基因启动子甲基化，研究DAPK1基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义。
　　1 资料与方法
　　1.1 研究对象
　　选择2010年1月～2013年6月初治宫颈癌患者为研究目标，经临床表现、症状体征、影像学、细胞学和（或）病理组织学确诊为宫颈癌。本组研究对象包括80例宫颈癌患者，年龄32～78岁，平均（51.3±12.7）岁。另以同期健康体检的50例正常女性为对照，年龄30～80岁，平均（51.5±13.3）岁。两组研究对象在年龄等方面的差异无统计学意义（P > 0.05）。
　　1.2 材料与试剂
　　所有研究对象宫颈取活检组织后立即提取基因组DNA，根据基因组DNA提取试剂盒操作说明进行，提取的DNA立即行甲基化检测或-20℃保存待检。
　　1.3 DAPK1基因启动子甲基化检测
　　采用甲基化特异性PCR检测DAPK1基因启动子甲基化。将提取的基因组DNA行重硫酸盐转化。引物采用在线引物设计软件Methprimer（http：//）设计。转化后的产物行PCR扩增，PCR序列见表1，反应条件为95℃预变性12 min，95℃变性1 min，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，共32个循环，最后一轮72℃延伸10 min。
　　1.4 统计学分析
　　统计学分析采用SPSS 11.5统计学软件。基因启动子甲基化与临床病理因素的关系比较采用χ2检验或Fisher精确概率法计算P值，P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　47例宫颈癌患者活检组织检测到DAPK1基因启动子甲基化，甲基化率为58.8%，正常女性中2例检测到DAPK1基因启动子呈甲基化，甲基化率为4.0%，宫颈癌患者宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化率显著高于正常女性（P < 0.05）。宫颈癌患者DAPK1基因启动子甲基化率在年龄、吸烟史、酗酒史和病理类型方面无明显差异（P > 0.05），在HPV感染、分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移和Figo分期中的差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
　　表2 不同临床病理因素宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化的差异
　　3 讨论
　　DNA甲基化是表观遗传学最主要的调控基因表达方式，甲基化可导致染色质空间结构发生改变，甲基化CG或结合甲基结合蛋白后可阻遏转录因子结合到转录起始点，导致基因无法复制而抑制基因表达，因真核生物的CpG岛主要分布于启动[论文写作 ]子区域，故目前研究DNA甲基化主要集中在基因启动子[4，5]。越来越多的研究证实，基因启动子甲基化导致基因表达下降，其甲基化率与肿瘤的病情及预后密切相关，较传统的蛋白质水平的标志物具有更高的灵敏度和特异性[6]。DAPK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是新近发现的抑癌基因，可调控细胞周期，可促进正常细胞发生凋亡，与肿瘤的发生、发展紧密相关[7]。目前研究发现，DAPK1基因启动子甲基化在消化道肿瘤、呼吸系统肿瘤等众多肿瘤中处于高甲基化、表达缺失状态，且其甲基化与病情及预后相关，甲基化率越高意味着肿瘤患者病情越重、预后越差[8]。我们的研究发现，宫颈癌患者DAPK1基因启动子甲基化发生率显著高于正常女性，证实与其他肿瘤类似，宫颈癌患者存在DAPK1基因启动子高甲基化状态。
　　在本研究中，肿瘤分化程度低、肿瘤直径大、有淋巴结转移、远处转移及分期晚的患者宫颈活检组织DAPK1基因启动子甲基化率显著高于分化程度高、肿瘤直径小、无淋巴结转移、无远处转移及分期早的宫颈癌患者，这些数据均表明DAPK1基因启动子甲基化在宫颈癌病情及预后中具有一定价值。有研究表明DAPK1基因甲基化与HPV感染密切相关，花敏慧等[9]研究证实DAPK1甲基化是宫颈癌发生的早期事件，且其与高危型HPV感染呈正相关。基于肿瘤的分化程度和临床分期与宫颈癌病情及预后密切相关这一事实，推测DAPK1基因启动子甲基化可作为宫颈癌基因层次的标志物，可能在宫颈癌的诊断、病情与预后评估中扮演重要角色。此外，DAPK1基因启动子甲基化或许能反应HPV感染，尤其在无法直接取得HPV感染证据下检测基因水平的DAPK1基因启动子甲基化有利于对HPV治疗做出评价。值得一提的是，目前尚无DAPK1与宫颈癌的相关研究，本研究仅仅在临床病理因素方面发现DAPK1与宫颈癌的关系，其具体作用机制有待于进一步研究。
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